基因芯片是指固定有许多有序列的寡核苷酸探针的载体,通过杂交检测,对各种基因进行分析[ 1 ]
。由于它所具有的高通量性、快捷、便宜等优点,在各个领域起着越来越重要的作用,其中也包括分子流行病学领域。基因芯片主要用于菌株的地理流行病学分析、菌株的重要分子特征相关的流行病学分析———分子流行病学的病因学研究及传染病的诊断与鉴别诊断。本文主要从芯片的原理、应用及所存在问题等几方面,初步探讨基因芯片在传染病流行病学应用中的广阔前景。
一、基本原理
Fodor 等[ 2 ]于1991
年首先提出了基因芯片的概念,进而随着分子生物学的突飞猛进,尤其是人类基因组计划的完成及后基因组研究工作的开展,基因芯片技术日趋成熟。它是一种通过微加工技术将成千上万个寡聚核苷酸或cDNA
固定在一个很小的芯片上,用以对各种基因进行检测和分析。目前,基因芯片的种类主要包括寡核苷酸芯片、cDNA 芯片、肽芯片和芯片实验室(lab
on a chip) 。芯片技术由于其高通量分析特征,对于分子生物学、分子流行病学及其他相关学科的研究将产生难以估量的影响。
基因芯片的基本原理是通过原位杂交方法,用已知的 DNA 序列检测未知序列。目前,基因芯片主要用于DNA 突变分析[ 3 ] 、基因谱差异分析[
428 ] 、基因诊断分析[ 9211 ]和大规模基因类型分析[ 12 ]
。其研制技术主要包括以下几大步骤:寡核苷酸探针的合成、固定、杂交和检测。
制造基因芯片的载体材料必须是固体片状或薄膜,其表面硅烷化后可通过连接物将各种生物分子固定,应用最普遍的是玻璃片。
目前,连接物通常是在醇化、氨化、二硫化或丙烯酰胺化处理的载体表面与探针连接[ 13218 ]
。寡核苷酸探针主要是通过获取mRNA、逆转录制备cDNA 探针获得。逆转录过程中加入同位素或荧光素修饰的dNTP 标记;然后将合成后DNA
固定法固定在玻片上;再用标记的样品与芯片上固定的探针间进行的特异性选择反应,即杂交反应;最后,通过荧光显微镜检测各杂交点的荧光信号强弱或不同荧光素的颜色(双色荧光素标记)
,也可用同位素标记、化学发光检测、电化学发光检测及质谱法等进行检测。目前,基因芯片主要用于未知 DNA 片段检测和基因谱差异分析。
国内外有许多网站对基因芯片的概念、制造、种类等方面有非常详细的报道[ 19222 ] ,本文不再赘述。
二、基因芯片在病原微生物及分子流行病学中的应用
目前,基因芯片在真核生物方面的应用较多,而在原核生物方面应用刚刚起步,但基因芯片在分子流行病学中的应
用已显示出广阔的前景,主要应用于以下这些领域。
1.
菌株的地理流行病学分析:由于受方法学的限制,传统的病原地理流行病学分析一次只能对病原体的少数基因进行分析,在实际分析中不可避免地会导致一些重要的数据的遗漏,这有可能使实验结论与实际结果出现偏差,而芯片技术从根本上解决了这个问题。目前,应用的实例很多,最有代表性的例子是有关对卡介苗(BCG)
的分析,卡介苗是计划免疫中非常重要的一种菌苗。由于卡介苗的原始出发菌株在一次世界大战中丢失,同时各国的卡介苗菌株通过多次传代,部分基因已发生改变或缺失,因此,各国的卡介苗菌株可能存在很大的不同,这就给全球范围内的计划免疫工作带来了很大的不便。Behr
等[ 23 ] 用DNA 芯片检测了多个国家卡介苗的子代菌株。他们通过人型结核杆菌H37Rv 的基因框架来分析卡介苗。用H37Rv 的全部3
924个开放阅读框 (ORF) 中的3 902个ORF 制成芯片,对不同的卡介苗进行杂交。通过比较,发现了卡介苗菌株16 个缺失区域,长度从 1
903到12 733 bp 不等,其中4 个区域已有报道。他们将这些缺失区域进行统一命名,从RD1 到RD16。其中9
个区域卡介苗及牛型结核杆菌( M. bovis) 菌株全部缺失,2 个区域卡介苗及牛型结核杆菌菌株部分缺失。1 个区域所有卡介苗株全部缺失。4
个区域存在某种卡介苗株缺失。对于卡介苗菌株间的不同,Behr 认为那些在牛型结核杆菌存在而在卡介苗中缺失的H37Rv
的区域是在传代过程丢失的。这些问题的解决对于疫苗评价以及改进有很大的意义,但用传统的分子生物学方法是不可能完成的。
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