BIACORE3000生物分子相互作用分析仪使用说明

BIACORE3000操作手册
本手册包括BIACORE3000工作原理，实验步骤，操作规程，注意事项等。

BIA是基于表面等离子体共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物的技术。表面等离子体子共振(surface plasmon resonance , SPR)是一种物理光学现象。在发生全反射的界面涂上一薄层金膜（或其它金属膜）约50nm厚，由于金膜中有自由电子，它们并不是静止不动而是不停在平衡位置附近振动，并具有一定的频率。当光由另一侧以大于临界角入射有金膜的界面，由于入射光会在界面方向有一分量，当这一分量与金膜中电子振荡频率相同时，两种能量会发生整合，使在某个角度上发射光能量降低，这个能量降低的角度成为SPR角。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时,SPR角的位置将不同，根据SPR角的变化可以推断所发生的变化。

BIA是英语“Biomolecular Interaction Analysis”的缩写，BIA提供了实时观察生物分子间相互作用的技术。通过它能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强，还能了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。BIA可以让得到用其他技术方法难以得到的结果，因为它可以实时反映分子结合过程中每一秒变化的情况。无需借助标记物进行分析使BIA广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。BIA就是利用金属薄膜表面的折射率的改变，引起共振角的变化，来推断金属薄膜表面的变化。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面分子的结合、解离整个过程的变化。

BIA技术应用的领域主要有四个方面：
1、动力学常数的测定2、测定样品浓度3、分析相互作用模式4、复合物功能分析

一、 动力学常数的测定通过实时监测结合在芯片表面分子质量的变化，可以得到两个分子之间的结合与解离常数。由于检测的是芯片表面质量的变化，所以大分子的分析物相互较容易得到较强的信号，但是对于小分子的分析物可以通过优化实验设计而进行检测。BIA可以用来分析不同抗体与抗原的结合与解离常数，相对与以前其它检测抗体效价的方法，BIA不仅快速，可以准确定量，和可以让你看到整个结合和解离的动态过程。

二、浓度的测量如果简单地测量一个纯物质的浓度，有很多方法可以选择。但是如果想知道，某种复合物中其中一个组分的浓度，则很难实现。用BIA技术可以很轻松做到这一点。先将待测物的抗体耦联到芯片表面，再将一系列不同浓度的标样流过芯片，得到一条标准曲线，此时将混合物流过芯片，根据信号强度大小就可以得到原混合物中某组分的浓度。如果待测物很小，可以采取竞争的方法实现。

三、分子相互作用模式的研究我们想知道两分子之间相互作用的比例，结合位点，抗原决定族的位点，都可以用BIA来完成。研究突变后活力大小的变化，研究复合物形成次序等等。

四、蛋白质功能分析复合物的组装可以看成研究蛋白功能的一个例子。也可以设计其它的一些实验，只要前后芯片表面的质量有变化就可以利用BIA技术来检测。

四、实验步骤
1、  preconcentration （预结合试验）
由于芯片表面带有负电，因此要偶联到芯片上的分子必须带上正电，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共价偶联反应的完成。预结合实验就是将样品溶解在不同PH值的缓冲液中，使其带上不同量的电荷。然后，将样品流过芯片表面，观察它与芯片的结合曲线，就可判断出合适的条件。如下图：两种不同条件下的吸附实验，第一个峰表明在该条件下，吸附很快达到饱和，这样吸附的量有限，第二种一直呈上升趋势，有利于在芯片上偶联较多的蛋白。实际工作中，还会碰到各种不同的吸附曲线，需要根据实际情况来判断最佳条件。 将抗体用不同PH值得buffer稀释10－40倍，以5μl/min的流速流过芯片表面，观察抗体与芯片的吸附结果。

2、  偶联
a) 取100μlNHS和100微升EDC混合，12000rpm离心5分钟；
b) 取一定体积的偶联蛋白，按预结合的比例稀释，稀释后需要150μl，取100μl ethanolamineHCL。以上试剂平衡到室温25摄氏度左右，高速离心五分钟；
c) 将上述三种试剂放在样品架上，设定加样流速为10μl/min，inject方式进样，NHS/EDC,样品，ethanolamine-HCl分别上样100，100，和60μl。
d)结束即可得到类似下图的曲线。

3、  结合
将抗原用合适的缓冲液稀释成适当浓度，离心后上样，观察抗原抗体结合过程。
如果需要测量不同条件下的结合状况，可以在一次进样结束之后，对芯片进行再生。然后再上下一个样品。
4、  芯片再生
抗原抗体结合的再生条件比较简单，简单地用PH2.5的10mMglycine冲洗就可以了。但实际工作中，如果偶联的是蛋白，往往情况要复杂得多。首先,再生条件要能将结合物从芯片上去掉，其次不能让结合在芯片上的蛋白变性失活。因为，万一所选条件使芯片上偶联的蛋白失活，这个通道就意味着报废。所以，芯片的再生是所有用户面临的一个比较头疼的问题。芯片再生要求再生之后，不仅要求基线要能回复到初始值，还要求再上相同的样品，结合能力不会出现明显下降。

5、  如果需要得到结合与解离的动力学常数，至少需要进行五组不同浓度的结合实验。

6、  分析实验结果，打印实验报告。

7、  仪器维护，实验完毕，running
buffer换成过滤并脱气的超纯水或HES－EP缓冲液。芯片更换为维护芯片，进行至少两遍prime后，运行standby。

8、  收拾整理实验场所。

附录
BIAcore 3000生物分子相互作用分析仪
BIAcore系统的3个核心部分是传感器芯片，SPR光学检测系统，微射流卡盘。

传感器芯片
传感器芯片是实时信号的传导载体。芯片是在玻璃片上覆盖了一层金膜，在金膜的表面连有不同的多聚物以形成不同的表面环境，以利于固定不同性质的生物分子。每个芯片表面有4个通道（FC），可以独立做4个不同的实验，也可以做实时的对照实验。

SPR光学检测系统
BIA技术是基于一种表面等离子共振（SPR）的物理光学现象的生物传感分析技术。不必使用荧光标记和同位素标记，从而保持了生物分子的天然活性。当入射光以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将产生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光可以引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定的角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，折射率的变化（RU）又和结合在金属表面的大分子质量称正比。因此，BIA技术可以通过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始的数据，并经相关处理获得结果－传感图。

微射流卡盘
微射流卡盘是一个液体传送系统，通过软件的控制自动地传送一定体积的样品至传感器芯片表面的不同通道。甚至自动进行样品的回收。
今天对生命科学奥秘的探索，已经不仅仅停留在是什么，而是要探询为什么。旨在揭示生命现象背后的机理研究，必然要理清生物分子间复杂的关系。只有Biacore能实时反映生物分子相互作用的整个过程，而不同于其他只能提供生物分子作用后的结果的方法，为您开辟一个崭新的研究角度。

BIA目前应用的领域有：
- 蛋白质组学研究（Proteomics）
- 癌症研究 (Cancer Research)
- 新药研发 (Drug Discovery)
- 信号传递 (Cell Signalling)
- 多分子复合物的结构和组装 ( Multi-molecular Complexes)
- 分子识别（Molecular Recognition）
- 免疫调节 (Immune Regulation)
- 免疫测定法 （Immunoassay）
- 疫苗开发 （Vaccine Development）
- 瞬时结合（Transient Binding）
- 配体垂钓 (Ligand Fishing)
- 结合特异性 （Binding Specificity）
- 结构与功能的关系 （Structure-function Relationship）
- 酶反应（Enzyme Reaction）

样品类型
小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂、噬菌体、病毒和细胞

操作流程
一、样品准备
样品包括耦联到芯片表面的分子（ligand）和在溶液中流过的样品，称作analyte。如果ligand是小分子，要检查该分子结构上是否有可供耦联的俄基团，如果没有需要考虑对分子进行修饰。
二、缓冲液准备
该实验要求所有缓冲液都经过过滤和脱气处理。如果缓冲液能够耐受高温的话，可以对缓冲液进行灭菌处理。这样灭菌有脱气的效果，同时也能保存更长的时间。
三、耦联 参照耦联的具体方法。
四、测试 将分析物用合适的缓冲液稀释处理，上样。要尽可能让样品缓冲液与系统载流缓冲液一致，
五、再生 再生是指将结合到芯片表面的分析物洗脱掉，以便芯片的重复使用。

日常维护
1、  每周要进行一次DESORB
2、  缓冲液要每天检查，脱气处理；