实验方法原理 胞核提取物可以用于前体 mRNA 的剪接，S100 提取物中虽然包括许多剪接因子，但它不具有剪接活性，因为它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白，不过该提取物中补充一种或多种 SR 蛋白后就可以进行有效的剪接。
实验材料 HeLa 细胞
试剂、试剂盒 DTT苯甲基磺酰氟PBS缓冲液
仪器、耗材 Eagle 悬浮培养基本培养基玻璃勾架器透析袋
实验步骤
―、材料与设备
所有的试剂均需用高质量高压灭菌水配制，例如 Mill Q ( Millipore，Bedford，MA，USA ) 或者双燕馏水。所有用于培养细胞的成分均需高压灭菌，不耐热的材料用 0.22 μm 过滤器过滤除菌。
1. HeLa 细胞悬浮培养
(1) 培养基：Joklik 修改后的 Eagle 悬浮培养基本培养基（ICN Pharmaceuticals 公司），或相当的培养基，这种粉末状的培养基包含除血淸外的所有必须物质。用 Milli Q 水溶解粉末并过滤除菌，配制成 5X 储备液，用过滤除菌水配制工作液并加入小牛血清至 终浓度为 50 ml/L，pH 约 7.0。
(2) HeLa 细胞：用适于在悬浮培养基中生长的细胞株，如 S-3 株。
2. 提取物的制备
试剂 (1) 和 (2) 储存液应保存于 -20℃，在使用前再加入溶液 (3)~(6)。
(1) 1 mol/L DTT。
(2) 20 mg/ml（115 mmol/L ) 苯甲基磺酰氟（PMSF)，溶于乙醇。
(3) PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L MgCl2。
(4) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0)，10 mmoI/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT。
(5) 缓冲液 B：0.3 mol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，1.4 mol/L KCl，30 mmol/L MgCl2。
(6) 缓冲液 C：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，0.6 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，25%（V/V）甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。
(7) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，20% ( V/V )甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。
(8) 40 ml Dounce 带较松研杵的玻璃勾架器。
(9) 截留分子质量为 12000~14000 Da 的透析袋。
二、操作方法
1. HeLa 细胞悬浮培养
细胞于 37℃ 在转动培养瓶中培养，细胞密度维持在 2X105~5X105。细胞倍增时间大约是 24 h，细胞密度可用血细胞计数器计数。
2. HeLa 细胞核提取物的制备
(1) 取对数生长期（4X105~6X105/ml，不超过 1X106/ml）的 HeLa 细胞用低速离心机在 1800 g 离心 10 min，收集细胞。
(2) 用冰冷的 PBS 轻轻地重悬细胞，再离心，确定细胞沉淀的体积（PCV )。后面所有的步骤都应该在冰上或者在冷室里进行，所有的离心步骤应该在 4℃ 进行。
(3) 将细胞沉淀轻轻地重悬在 5 倍 PCV 的缓冲液 A 中，冰上放置 10 min，使细胞在低渗缓冲液中膨胀。
(4) 于 1800 g 离心 10 min，沉淀细胞。再用 2 倍 PCV 的缓冲液 A 重悬细胞。由于膨胀，细胞沉淀体积会加倍，计算时釆用原来的 PCV。
(5) 用 Dounce 玻璃匀浆器匀浆大约 10 次。细胞裂解的程度通过台盼蓝染色以血细胞计数器检测，目标是 90% 的细胞裂解，但匀浆不要超过必需的次数。注意 HeLa 细胞核很大，并不比完整的细胞小多少。
(6) 裂解液转入高速离心管中，于 1200 g 离心 10 min，用吸管小心取出上清加入一个量筒中以制备 S100 提取物。
(7) 在同一离心管中以 33000 g 离心 20 min，小心吸弃上清。
(8) 12 升 HeLa 细胞培养物获得的浓缩胞核体积（PNV ) 通常为 9~15 ml。加 2 ml 缓冲液 C，旋动以使沉淀与离心管分离，但是不要使沉淀散开，将沉淀和液体转移到带刻度的一次性试管，测量体积，然后减去 2 ml 为估计的 PNV，加入更多缓冲液 C ( 含 0.6 mol/L KCl ) 使 KCl 的终浓度为 0.24 mol/L，其范围应该为 0.20~0.25 mol/L。
(9) 将沉淀和缓冲液（还不要将沉淀重悬，否则溶液将变得黏稠且很难没有损失地转移 ) 转移到一个干净的 40 ml 玻璃 Bounce 匀浆器中，用一个较松的研杵匀浆几次使之悬浮。匀浆 10 次应该足以制备匀质的悬液。
(10) 将匀浆转移到一个或多个带螺帽的高速离心试管中并轻轻晃动混合 30~45 min。
(11) 高速离心（约 33000 g，30 min）沉淀盐洗过的细胞核，并小心地将上清转移到一次性试管中，避免沉淀的污染。
(12) 用缓冲液 D 透析上淸两次（通常用 1~2 L）。一次过夜，另一次至少 4 h。
(13) 33000 g 高速离心 20 min，去除透析过程中形成的沉淀，并小心地将上清（核提取物）转移到一次性试管中。
(14) 将提取物以 0.1~1 ml 分装到微量离心管中。将离心管放入液氮中快速冷冻，于 -70°C 或更低温度储存。
3. HeLa 细胞胞质 S100 提取物的制备
在等待操作1 "HeLa 细胞核提取物的制备" 中的步骤 (7) 的离心时，将第 (6) 步得到的上清进步处理可获得 S100 提取物，它包括胞质成分和许多（但非全部）核成分，它在低渗缓冲溶液 A 中提取。
(1) 测量上请液的体积，加 0.11 倍体积的缓冲液 B，轻轻混合。
(2) 在超速离心管中以 100000 g 离心 1 h。
(3) 将上清转入一次性试管中。
(4) 用缓冲液 D 透析 2 次，一次过夜，另一次至少 4 h。提取物的体积在透析期间显著缩小，这是因为缓冲液 D 中含有的甘油使提取物浓缩。
(5) 33000 g 高速离心 20 min 去除不溶物质。
(6) 将提取物以 0.1~1 ml 分装到微量离心管中，快速冷冻并如操作3 “HeLa 细胞核提取物的制备” 中的步骤 (14) 所述储存。12 升培养物可制备胞质 S100 提取物 40~55 ml，总蛋白浓度为 10~15 mg/ml 提取物活性可保持数年之久。
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