实验方法原理 前体 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR（serine/argininc rich，富含丝/苏氨酸）蛋白家族是将剪接体组装到前体 mRNA 上的重要参与者。SR 蛋白是重要的剪接因子，该家族的不同成员可以在体外或体内指导选择性剪接位点的选择。
实验材料 超纯硫酸铵
试剂、试剂盒 SR 蛋白提取缓冲液SR 透析缓冲液丙烯酰胺溶液蛋白加样缓冲液丙酮盐酸胍考马斯亮蓝染色液
仪器、耗材 大探头超声仪相差显微镜离心机离心管透析袋聚丙烯酰胺凝胶电泳装置
实验步骤
一、材料与设备
1. 从细胞和组织中纯化 SR 蛋白家族
(1) 低速离心收集培养至对数生长中期的细胞，4℃ PBS 洗 2 次，离心收集细胞并保存于 -80°C 备用。以下制备实验通常使用6X109~ 8X1011 个 HeLa 细胞或 4X1010~5X1015 个果蝇 Kc 细胞。将细胞沉淀在液氮中研磨成粉末，注意在加入提取缓冲液之前应将研钵置于干冰上预冷。
(2) 动物器官和组织可用下述方法制备。确保动物死后几分钟之内将组织保存于液氮或干冰中，用研钵将组织研成粉末，研钵应置于干冰上或液氮中，在研磨过程中应不断添加液氮，研碎的组织可保存于 -80℃ 备用。
(3) SR 蛋白提取缓冲液：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.6 )，67 mmol/L KCl，13 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，5 mmol/L KF，5 mmol/L β-磷酸甘油，0.2 mmol/L PMSF，配制 500 ml。
(4) SR 透析缓冲液：10 mmol/L HEPES-KOH（pH 7.6 )，67 mmoI/L KCl，13 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，5 mmol/L KF，5 mmol/L β-磷酸甘油，0.2 mmol/L PMSF，配制 4 L。
(5) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.6 )，5% ( V/V ) 甘油，0.1 mol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L DTT，配制 50 ml。
(6) 大探头超声仪：Branson 超声破碎仪 450 或同等的仪器，直径 0.5 英寸（1 英寸=2.54 cm ) 破碎探头。组织培养细胞以及研碎的组织置于 600 ml 烧杯中，在提取缓冲液中破碎。
(7) 相差显微镜，监测超声过程中钿胞破碎情况。
(8) 离心机及离心管：Backman J2 或等同离心机，JA-17 或等同转子，带盖 50 ml 聚丙烯离心管。
(9) 超速离心机和离心管：Beckman L7 或等同离心机，SW-28 或等同大容量吊桶转子以及配套离心管。
(10) 超纯硫酸铵：在使用前用研钵仔细粉碎。
(11) 90% 硫酸铵 SR 透析缓冲液：66.2 g 硫酸铵溶于 100 ml SR 透析缓冲液。
(12) MWCO ( 截留分子质量）6000~8000 透析袋，透析袋在 10 mmol/L NaHCO3 中煮 10 min，再在 10 mmol/L EDTA 中煮 10 min，再将透析袋在去离子水中充分冲洗，保存于 50% 乙醇中，置 4℃ 备用，然后用蒸馏水清洗透析袋，用于从分离物中透析硫酸铵。
(13) Eppendorf 5415 C 或等同台式离心机。
(14) 硅烷化的 1.7 ml 微量离心管。
(15) 1 moI/L MgCl2 溶液。
(16) 杯-角超声波探头：直径 2 英寸，Branson Ultrasonic 生产（Danbury，CT，USA ) 或等同仪器。Mg2+ 沉淀的 SR 蛋白通过超声重悬于缓冲液 D 中。
2. 从变性聚丙烯酰胺凝胶中分离单一 SR 蛋白
(1) 16 cm 高垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，0.75 mm 厚的垫片及用于制备凝胶的梳子。
(2) 10% 丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺 29.2：0.8。电泳缓冲液：0.025 mol/L Tris 碱，0.192 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS。分离胶溶液：10% 丙烯酰溶液，0.375 mol/L Tris-HCl（pH 8.8 )，0.1% SDS。浓缩胶丙烯酰胺溶液：4% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰 29.2：0.8），0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8 )，0.1% SDS。
(3) 0.25 mol/L KCl，4℃ 预冷。
(4) 2X蛋白加样缓冲液：0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)，4% SDS，20% 甘油，10% β-巯基乙醇。
(5) 蛋白洗脱缓冲液：0.1% SDS，50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)，5 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，0.1 mg/ml 乙酰化牛血清白蛋白，使用前现配。
(6) 丙酮，预冷至 -20℃。
(7) 微量离心机，预冷至 -20℃。
(8) 6mol/L 盐酸胍，用缓冲液 D 配制。
(9) MWCO 6000~8000 透析袋，微透析腔。微量透析仪：Spertrum Spcctra/por (Houston, TX, USA)。
(10) 考马斯亮蓝染色液：0.125％ 考马斯亮蓝 R250 溶于 50% 甲醇、10% 乙酸中。染色 20 min 后脱色，先在 50% 甲醇和 10% 乙酸中脱色 15 min，再用 5% 甲醇和 7% 乙酸脱色。
二、操作方法
1. 纯化 SR 蛋白家族 65%~90% 硫酸铵组分
(1) 在 600 ml 烧杯中加入适量的细胞如约 5X1011 哺乳动物组织培养细胞，4X1010 昆虫组织培养细胞或 100 g 粉状组织如牛胸腺（保存于 -80℃），加入 330 ml 预冷至 4℃ 的 SR 提取缓冲液，置于冰上。在烧杯中加入搅拌子，将冰冻的粉状物和缓冲液搅匀。
(2) 4°C 搅拌 5 min。
(3) 用大探头于 4℃ 超声破碎细胞，将超声仪功率调至将近最大值。用搅拌每隔 30~60 s 搅拌一次以保证均匀超声。每 5 min 用显微镜检杳细胞破碎情况，可能组织需要时间长达 15 min，而培养的细胞则只需 5 min，在超声前制备涂片作为对照。
(4) 将样品移入预冷的 50 ml 离心管中，用 JA I7 转子于 4℃ 10000 r/min 离心裂解细胞 20 min。
(5) 离心后，将离心管置于冰上，去除提取物上层的脂层，将所有上清液合并于预冷的 600 ml 烧杯中，置于冰上。用预冷的 500 ml 量筒测定提取物的准确体积。
(6) 在烧杯中加入磁力搅拌子，4℃ 缓慢搅拌，缓慢加入研细的硫酸铵，在 15~20 min 内达到 65% 的饱和度。在使用前要确保硫酸铵为细粉末，可用研钵粉碎（要达到仍 65％ 的饱和度，在每毫升提取物中加入 0.43 g 硫酸铵。
(7) 当所有的硫酸铵加完后，4℃ 搅拌 1.5 h。
(8) 将提取物转移到 50 ml 预冷的离心管中，用 JA-17 转子 10000 r/min 离心 20 min。
(9) 离心后，将管置于冰上，去除上层脂层。
(10) 将上清倒入干净预冷的 50 ml 离心管中，用 JA-17 转子 4℃ 10000 r/min 离心 20 min。
(11) 离心后，将管置于冰上，去除上层可能存在的脂层。
(12) 将所有的上清并入预冷的 600 ml 烧杯中，置于冰上，用预冷的 500 ml 量筒测定提取物的准确体积。
(13) 在烧杯中加入磁力搅拌子，4℃ 缓慢搅拌，加入研细的硫酸铵，在 15~20 min 内达到 90% 的饱和度（为了达到 90% 的饱和度，在每毫升含硫酸铵的提取物中加入 0.19 g 硫酸铵）。
(14) 用塑料膜封住烧杯口，搅拌提取液过夜。
(15) 第二天，将样品分装于预冷的微量离心管中。
(16) 在 Beckman L7 超速离心机上使用 SW28 转子，于 8°C 25000 r/min 离心 1 h。
(17) 缓慢弃去离心管中的上清。
(18) 沿管壁缓慢加入 3 ml 预冷至 4℃，含 90% 硫酸铵的 SR 透析缓冲液，小心勿触动沉淀。
(19) 在置于冰上的每个离心管中加入 0.5 ml SR 透析缓冲液（不含硫酸铵）。
(20) 将所有悬浮的沉淀并入一个管中。用 1 ml SR 透析缓冲液依次冲洗离心管，将洗涤液并入样品管中，此时样品的总体积应为 6 ml 左右。
(21) 用蒸馏水清洗 15.24~17.78 MWCO 6000~8000 透析袋，用夹子夹住袋底。
(22) 将重悬的沉淀物移入透析袋中，夹紧袋子上部。
(23) 用 1300 ml SR 透析缓冲液于 4℃ 透析 1 h。
(24) 更换缓冲液，再用 1300 ml 缓冲液透析 2 h。
(25) 再更换 1300 ml 缓冲液，于 4℃ 透析过夜。
(26) 第二天，将透析过的溶液分装于 1 ml 硅化的微量离心管中。
(27) 将离心管置于干冰上进行速冻。
(28) 制备溶液时可长期保存于 -80℃。
2. SR 蛋白的沉淀
(1) 在冰浴中解冻透析过的 65％~90% 硫酸铵组分。
(2) 离心去除沉淀的蛋白，在微量离心机上于 4°C 14000 g ( 13000 r/min ) 离心 30 min。对于较大体积的蛋白样品，可将透析的组分移入 15 ml Corex 离心管中，用 JA17 或等同的转子于 4℃ 10000 r/min（10000 g）离心 30 min。
(3) 用移液器将澄清的上清转移到新的预冷的 Corex 管或硅化的微量离心管中，避免吸到沉淀，注意宁可损失一些上清也不要带入沉淀物。
(4) 加入 1 mol/L MgCl2 溶液至上清液中，终浓度为 15 mmol/L 混匀，将离心管置于冰上 1 h。
(5) 按第 (2) 步离心 MgCl2 处理过的溶液。
(6) 弃上清，吸取少量 SR 透析缓冲液（含 20 mmol/L MgCl2）至离心管中用以清洗沉淀物。注意少量，能够覆盖沉淀即可，尽量去除清洗缓冲液，可以短暂离心以保证清冼缓冲液集中于管底并完全去除。
(7) 将沉淀重悬于缓冲液 D 中，对于 Corex 离心管中的沉淀，吸取 200~400 μl 缓冲液 D 并轻轻上下吹打，注意吹打动作要轻以免样品损失。将重悬的沉淀转移到硅化的微量离心管中，再用 100 μl 缓冲液 D 冲洗离心管，将洗液并入微量离心管中。对于微量离心管中的沉淀，每毫升 65%~90% 透析过的硫酸铵组分所得沉淀加入 20~100 μl 缓冲液 D，注意不要上下吹打沉淀物。在以上两种情况下，将微量离心管置于 4°C 杯角超声浴中，将杯角探头的功率设置到最大值，超声 30 s，如有必要可重复几次，注意保持超声浴为 4℃。
(8) 重悬的 SR 蛋白的纯度可以通过 SDS PAGE 胶电泳分析，将同一蛋白的考马斯亮蓝染色结果与 mAb104 抗体免疫印迹结果相比较以进行鉴定。根据经验，银染方法不适于检测 SR 蛋白。
3. 单一 SR 蛋白的 SDS-PAGE 纯化和复性
(1) 用 0.75 mm 厚的边条，制备 5~8 cm 宽、4 cm 高的 10% 浓缩胶制备性凝胶，待凝胶聚合数小时后再使用。
(2) 在经镁离子沉淀并重悬于缓冲液 D 的 SR 蛋白溶液中加入等量 2X 蛋白上样缓冲液。对于上面所说的制备性凝胶，从 100 g 小牛胸腺所得的 SR 蛋白量可以取得最好的回收效果。应该注意在重悬时使样品保持较小的体积，同时不要直接用蛋白上样缓冲液重悬沉淀或在用于镁离子沉淀蛋白管中加入上样缓冲液。
(3) 样品于 90℃ 加热 5 min。
(4) 将样品加样于制备的胶中，同时预染分子质量标准蛋白上样，另留 1% 的样品单独上样，使该泳道紧靠预染分子质量标准蛋白泳道。
(5) 100V 电泳 7 h，或使指示剂电泳至凝胶底部。
(6) 取下凝胶，将预染分子质量标准及单独上样泳道切下，用考马斯亮蓝染色留做记录。
(7) 将包含制备泳道及预染分子质量质标准蛋白泳道的凝胶浸于 500 ml 4℃ 预冷的 0.25 mol/L KCl 中，浸泡 10 min。
(8) 将胶置于玻璃板上，再置于黑色背景上，在有蛋白存在处，KCl 可与蛋白中的 SDS 作用，形成可见的亮白色沉淀。
(9) 将单个蛋白条带分別用刀片切下，转入 15 ml 锥形管中。
(10) 在每个管中加入 10 ml 4℃ 预冷的 1 mmol/L DTT，室温浸泡 3 min，弃去管中溶液。
(11) 将研钵置于冰浴中，加液氮于研钵中，用镊子将凝胶移入液氮中，缓慢将凝胶研成细粉。
(12) 使用在干冰上预冷的称量纸，将研钵中的粉末状碎凝胶转移到 15 ml 锥形管中或硅化的 1.7 ml 微量离心管中。
(13) 加入新鲜配制的 0.5~2.0 ml 洗脱缓冲液，根据凝胶的量调整缓冲液用量，最好让凝胶粉末和洗脱缓冲液的体积相等。
(14) 室温条件下旋转混合过夜，洗脱凝胶中的蛋白。
(15) 室温高速离心 5 min，分离溶液和凝胶。
(16) 用移液器将上清移至硅化的微量离心管中，如果体积较大，则将上清分装于多个管中，注意每管体积勿超过 800 μl。
(17) 高速离心 5 min 以将可能存在的凝胶沉淀下来。
(18) 将上清转移至新的硅化微量离心管中，注意不要带出可能存在的凝胶，用移液器测定每管中上清的体积。
(19) 将管置于冰盐浴中（5 mol/L NaCl 溶液与冰混合），-20 ℃ 放置 10 min。
(20) 在每个管中加入预冷至 -20℃ 的丙酮，快速将管上下颠倒混匀，继续置于冰盐浴中。
(21) 将冰盐浴中丙酮沉淀物置于 -20℃，放置 20 min。
(22) 将管置于预冷至 -20°C 的离心机中，13000 g 离心 20 min。
(23) 快速从离心机中取出离心管，并置于冰盐浴中，立即置于冷室。
(24) 在冷室中，尽可能弃去上清，在管中加入 100 μl 用缓冲液 D 配制的 6 mol/L 盐酸胍。
(25) 将管在 4℃ 放置 5 min。
(26) 将管置于室温，开盖放置 15 min，使残留的丙酮挥发干净。
(27) 盖上管盖，超声 30 s，以利于重悬沉淀。
(28) 室温开盖放置 15 min。
(29) 室温 13000 g 离心 10 min，除去不溶于盐酸胍的蛋白。
(30) 将上淸液加入微透析装置，用 MWCO 6000~8000 透析袋 4℃ 用蠕动泵以 1 ml/min 流速对含 5 mmol/L β-磷酸甘油的缓冲液 D 进行透析，样品的透析最少需要 3 h，但不要超过 7 h。
(31) 将透析后的溶液移入微量离心管中，用 50 μl 缓冲液 D 冲洗透析孔，将洗液并入蛋白样品。
(32) 4°C 13000 g 离心 30 min 以去除由于盐酸胍被透析产生的不溶蛋白。
(33) 将上清移入新的微量离心管中，加入 1 mol/L MgCl2 至终浓度为 20 mmol/L。
(34) 将离心管置冰上，4℃ 过夜。
(35) 4°C 13000 g 离心 30 min。
(36) 去除上清，在沉淀中加入 20~60 μl 缓冲液 D。
(37) 将超声仪功率设至最大，在冰水浴中超声 30 s 以重悬沉淀。
(38) 取 2~4 μl 样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色鉴定 SR 蛋白的纯度。同时倍比稀释已知量蛋白，上样于同一块凝胶，根据考马斯亮蓝染色强度大致判定制备的 SR 蛋白的浓度。
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