膜蛋白的纯化实验（二）

三、膜蛋白的纯化

一 旦 使 用 了 合 适 的 去 污 剂 将 膜 蛋 白 从 细 胞 膜 中 増 溶 出 来 ，就 可 以 分 离 目 标 蛋 白 质 了 。传 统 色 谱 层 析 技 术 ，如 凝 胶 过 滤 、亲 和 、离 子 交 换 和 层 析 聚 焦 （chromatofocusing)等 都 可以 用 于 膜 蛋 白 纯 化 。然 而 ，在 去 污 剂 存 在 条 件 下 使 用 色 谱 层 析 需 要 注 意 以 下 几 点 。

(1) 使用足量的去污剂，以维持整合膜蛋白在缓冲液中处于可溶形式并防止蛋白质聚集。

(2) 由于大多数去污剂具有疏水性，基于蛋白质疏水性的蛋白质分离方法，如苯基-琼脂糖凝胶和反相层析也许不适于膜蛋白的纯化。

(3) 增溶膜蛋白的离子型去污剂，如胆酸盐或脱氧胆酸盐，不适用于离子交换层析。非离子型或兼性去污剂则可用于基于电荷的制备技术, 包括离子交换层析和制备电泳。

(4) 含糖基的去污剂也许会干扰特定的凝集素层析，如 辛 基 葡 糖 苷 会 干 扰 ConA层 析 。

(5) 由于溶解的膜蛋白处于去污剂胶束中，在凝胶过滤中膜蛋白具有更大的表观分子质量。能形成大分子质量胶束的去污剂，如 Trtion X-100, 会使溶解的膜蛋白的分子质量 增 加 60〜100 kDa。因此, 大多数蛋白质会出现在高分子质量部分，从而使基于分子大小的蛋白质分离变得困难。

(6) 膜蛋白与去污剂胶束的结合，特别是具有大胶束尺寸或本身为离子型的去污剂，会遮蔽膜蛋白的电荷。因此，离子交换层析分离膜蛋白的能力也许不如非膜蛋白。

(7) 整体而言，亲和层析是目前纯化整合膜蛋白最有用和最成功的方法, 并且在各个纯化阶段都能使用。由于离子交换层析对缓冲液的离子强度敏感，而凝胶过滤要求相对小体积的浓缩样本, 因此亲和层析可以用于纯化、浓缩以及在不同层析步骤中进行盐置换 。几种常用的膜蛋白纯化的亲和层析方法将在下面的部分中阐述。

4.1 凝集素亲和层析

有 3 种类型的亲和层析分别使用一般配体(如凝集素）、特异性配体(如酶抑制剂、激素)和抗体。固定的凝集素是亲和层析的常见形式。凝集素是糖结合蛋白，可用于快速并温和地纯化质膜糖蛋白。凝集素-糖的相互作用可逆并且可以被单糖抑制。由于膜蛋白常常是糖基化的，因此凝集素层析对于纯化膜蛋白非常有用。 目前已经鉴定了大量的凝集素 ，其中使用最广泛的是ConA[结合右旋甘露糖ct(crI> mannose)]和麦胚凝集素[germ
agglutinin, 结合唾液酸和乙酰氨基葡萄糖(3(sialic acid and ^ I> GIcNAc)]。这里需要提及使用凝集素亲和层析的几个方面。首先 ，目标蛋白质是否能够与特异的凝集素结合需要实验验证。由于不同的组织具有不同的糖基化酶，有时在相同动物的不同组织表达的同一糖蛋白也许会具有不同的凝集素结合特异性。其 次 ，特定的凝集素的亲和层析纯化的是一组具有特定糖基化类型的糖蛋白，因此并不能达到配体或抗体亲和层析方法达到
的纯化程度。最 后 ，凝集素对特定类型的去污剂敏感。虽然非离子型去污剂，如 Tritonx -100(可 至 2. 5 % ，m /V )对 C o n A 或麦胚凝集素配体结合活性的影响可以忽略，但一些离子型去污剂，如 S D S 也许会失活凝集素。

下面是一个使用凝集素柱纯化膜蛋白的实验方案范例。

(1) 转 移 2 mL麦胚凝集素(WGA)-琼脂糖到一 次性的塑料柱子(PolyPrep，Bio-RadLaboratories) 中 ，清 洗 WGA-琼 脂 糖 亲 和 基 质 。用1〇 mL 清 洗 缓 冲 液 [50 mmol/LH E P E S ( p H 7. 〇 、0.1 % 去污剂]充满柱子，让洗液流过柱子以除去未结合的W G A 和保存缓冲液。

(2) 在溶解的细胞膜提取物中加入清洗过的WGA-琼脂糖。在室温转动或振荡器上振 荡 3〇 min, 使 WGA-琼脂糖和可溶细胞膜提取物混合。

(3) 600 r/m in 离 心 I m in 以沉淀 WGA-琼脂糖。用移液管吸出上清液。加 入 1〇倍体积(基于WGA-琼脂糖的体积)的洗液，颠倒数次。

(4) 重复步骤(3)两次。

(5) 加 人 2 m L 洗液到W G A -琼脂糖，再 将 W G A -琼脂糖移回柱子。用 5〜10倍柱体积的洗液清洗。定时进行蛋白质检测，如用考马斯亮蓝蛋白质检测方法直到蛋白质水平降至背景值，即与洗液中蛋白质水平相似。

(6) 加人一半柱体积的洗脱缓冲液, 如5〇 mmol/L H E PE S(PH 7. 4)、0. 1 % 去污剂、0•25m 〇I/L N -乙酰氨基葡糖, 从W G A -琼脂糖上洗脱糖蛋白。收集洗脱部分。

(7) 加人一半柱体积的洗脱缓冲液, 收集洗脱部分。

(8) 重复步骤(7)4次。

(9) 检测洗脱液中的蛋白质浓度。例如, 从每份洗脱液中吸出5 pL 并用考马斯亮蓝方法检测蛋白质浓度。将适当的部分汇集在一起。

4.2 配 体 亲 和 层 析

配体亲和层析成功的关键是配体和受体的亲和要足够强，能够允许纯化步骤中的结合和清洗。配体通常通过偶联固定到亲和基质（affinity support)上 。由于去污剂的存在 ，配体(或抑制剂）和受体的亲和性也许会被改变。因此, 如果使用配体亲和柱纯化, 关键在于选择不会显著降低受体和配体亲和活性的去污剂。

4.3 抗 体 亲 和 层 析

如果有可用的抗体，则使用特定膜蛋白的固定化抗体是纯化膜蛋白最有力的方法。抗体在非离子型去污剂中相对比较稳定，因此能够与溶解的细胞膜制备物中的去污剂兼容 。困难在于从免疫亲和柱上洗脱膜蛋白（ 详 见 第 2 8 章）。

四、去污剂的去除和置换

如果将去污剂完全去除，大多数膜蛋白会聚集并沉淀。因此，为了保持膜蛋白的功能 ，在去除一种去污剂的同时通常会引入另一种去污剂。在一些情况下, 如在起始增溶阶段 ，样品中过量的去污剂会干扰蛋白质的活性和浓度测量，这时需要去除过量的去污剂。在 另 一 些 情 况 下 ，用 于 增 溶 的 起 始 去 污 剂 也 许 不 适 于 后 续 的 层 析 或 分 析 步 骤 ，有 必 要 置 换为 另 一 种 去 污 剂 。例 如 ，离 子 型 去 污 剂 与 离 子 交 换 层 析 和 等 电 聚 焦 不 兼 容 ，需 要 将 其 置 换为 非 离 子 或 兼 性 去 污 剂 。如 果 膜 蛋 白 需 要 重 组 合 到 磷 脂 囊 泡 中 ，需 要 改 为 具 有 高 临 界 胶束 浓 度 的 去 污 剂 , 从 而 可 以 通 过 透 析 方 法 除 去 去 污 剂 而 使 膜 蛋 白 重 组 合 到 磷 脂 囊 泡 中 。去 污 剂 是 否 容 易 去 除 与 其 性 质 具 有 很 大 关 系 。高 临 界 胶 束 浓 度 (>1 mmol/L) 的 去 污 剂 ，如 胆 酸 盐 和 辛 基 葡 糖 苷 ，透 析 或 超 滤 就 能 轻 易 去 除 。低 临 界 胶 束 浓 度 (<1 mmol/L) 的去污 剂 ，如 非 离 子 型 去 污 剂 Triton X-100、C12E9 、Brij、Tween，很 难 通 过 透 析 去 除 ，可 以 使用 层 析 基 质 吸 附 、凝 胶 过 滤 、平 衡 的 方 法 。去 污 剂 的 去 除 和 置 换 方 法 见 第 4 1 章 。

五、重组整合膜蛋白的表达和纯化

蛋 白 质 结 构 研 究 或 为 了 生 产 针 对 膜 蛋 白 的 抗 体 ，通 常 需 要 表 达 和 纯 化 重 组 的 整 合 膜蛋 白 以 获 得 足 量 蛋 白 质 。膜 蛋 白 通 常 采 用 哺 乳 动 物 细 胞 或 昆 虫 细 胞 表 达 。信 号 序 列 对 于将 蛋 白 质 靶 定 到 内 质 网 非 常 重 要 ，它 会 影 响 蛋 白 质 的 合 成 和 翻 译 后 的 修 饰 。 因 此 ，标 签 通常 加 在 序 列 末 端 以 避 免 影 响 蛋 白 质 的 膜 靶 向 过 程 。有 时 ，来 自 其 他 蛋 白 质 的 信 号 序 列 被
用 于 提 高 膜 靶 向 的 效 率 。小 的 标 签 ，如 His6 标 签 或 短 肽 标 签 ，不 会 给 蛋 白 质 带 来 很 大 的改 变 ，还 能 提 高 异 源 细 胞 表 达 膜 蛋 白 的 概 率 。金 属 亲 和 层 析 具 有 高 亲 和 能 力 且 不 受 去 污 剂的 影 响 ,Xt 于 表 达 和 纯 化 膜 蛋 白 来 说 是 一 个 好 的 选 择 。其 他 亲 和 表 位 标 签 ，如 FLAG、 Myc或 H A 也 能 使 用 。然 而 ，用 固 定 抗 体 纯 化 蛋 白 质 能 力 有 限 并 且 成 本 比 金 属 亲 和 层 析 高 得 多 。

多 篇 文 献 中 都 可 找 到 表 达 和 纯 化 膜 蛋 白 的 例 子 。一 个 例 子 是 用 昆 虫 细 胞 表 达 和 纯 化细 胞 黏 附 分 子 CEACAMKPhanetaL ,2001)。在 这 个 研 究 中 ，被 表 达 的 整 合 膜 蛋 白 C 端有 一 个 7 个 组 氨 酸 的 标 签 并 采 用 了 原 始 信 号 序 列 ，结 果 发 现 重 组 的 CEACAM1 蛋 白 定 位于 细 胞 膜 。细 胞 被 裂 解 后 用 Triton X- 1 0 0 溶 解 细 胞 膜 ，并 用 金 属 亲 和 层 析 一 步 纯 化 带His 标 签 的 CEACM1 。