实验材料 T4DNA 连接酶 T4 多聚核酸激酶 RNA 供体 受体 寡核苷酸 cDNA 模板

试剂、试剂盒 10X 连接缓冲液 [Y32P]ATP 无 RNase 水 l0 mmol LATP RNasin。 无 RNase 的 DNase。 5XTBE 2X 变性胶上样缓冲液 TE

仪器、耗材 真空离心浓缩仪

实验步骤

一材料与设备

1)T4DNA 连接酶

2)T4 多聚核酸激酶

3)RNA 供体

4) 受体

5) 寡核苷酸 cDNA 模板

6)10X 连接缓冲液：500 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，100 mmol/LMgCl2，200 mmol/LDTT,0.5 mg/mLBSA(适用 NewEngtandBiolabs 连接酶）或 660 mmol/LTris-HCl(pH7.6)，66 mmol/LMgCl2,lOOmmol/LDTT(适用于 Amersham/USB 连接酶）

7)[Y32P]ATP(10mCi/ml,300Ci/mmol=3.33umol/L)

8) 无 RNase 水

9)l0 mmol/LATP

10)RNasin。

11) 无 RNase 的 DNase。

12) 真空离心浓缩仪。

13）5XTBE:54 gTris，27.5 g 硼酸，20 ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

14)2X 变性胶上样缓冲液：10mol/L 尿素，1XTBE 或 80% 甲醛，1XTBE

15)TE；10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA

二、操作方法

1. 磷酸化 3＇RNA

1) 在 1.5 ml 管中加入 5ul[γ32P]ATP(50ulCi,16pmol)，用真空离心浓缩仪干燥。

2) 在此管中加入：0.5ul10X 连接缓冲液，3ul20umol/L3＇RNA,1ul 水，0.5ulT4 多核苷酸激酶, 终体积为 5.0ul

3) 于 37℃: 孵育 30〜60 min

4) 于 75°C 孵育 l0min 或 92〜95℃ 孵育 2 min, 灭活多核苷酸激酶。置于冰上

2. 连接反应

1) 在灭活的多核苷酸激酶反应管中，加 1.0ul10×连接缓冲液.3.0ul20umol/L5＇RNA,3ul20umol/LcDXA 模板。

2) 加热至 75℃ 2 min 再室温放置 5 min, 杂交 RNA 与 DNA。

3) 在杂交反应液中加入 1.l0 mmol/L 冷 ATP，2ul T4DNA 连接酶，至终体积 15ul

4) 于 30°C 孵育 2〜4 h。

5) 加 lul 无 RNase 的 DNase, 于 37℃ 孵育 15〜30 min

6) 加 16ul 2X 上样缓冲液，上样电泳，可以检测到标记的 5＇RNA 与 3＇RNA 以及相成于连接产物的全长分子。

注意事项

对于有效的连接，桥梁 cDNA 模板的浓度非常重要，最好等于或介于两种待连接的 RNA 分子的浓度之间，如模板过量，RNA 分子就会与不同的 cDNA 模板结合，而无法同另意 RNA 分子结合。我们建议连接反应中 RNA 的浓度最好为 0.1〜10umol/L