钙离子和镁离子通过形成磷酸盐-Ca 或磷酸盐-Mg 桥而改变 HA 表面, 尽管最初提出是在 20 多年前，但是最近 Gorbunoff(1984a;1984b) 和 Gagnon 等（2009) 才使用 Ca-修饰的陶瓷化 HA 表面对从 Mab 和 Fc 抗体组分中纯化 Fab 进行改进。这些研究表明，在经过 20 个柱体积的较低浓度磷酸盐缓冲液的处理之后，Ca-修饰的陶瓷化 HA 可以恢复天然形式。
如
Krane 和 Glimcher(1962) 所述，HA 同样具有高度的焦磷酸盐（pyrophosphate,PR)
和多聚磷酸盐亲和力。在无水的磷酸二氢钠和憐酸氢二钠中，PH
是一种污染物，而且对于相应的两种钾盐来说或许也是一种污染物。相对于^^八对蛋白质的吸附与解吸附，磷酸盐缓冲液中存在的 PR
既有优点也有缺点。如图 24.i 所示，采用无水的磷酸钠配制的磷酸盐缓冲液对牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原又和细胞色素 c 进行分离。图
24,2 所示为采用 Na2 HPO347 氏 o 和 NaHJO4 h2o
配制的磷酸钠缓冲液进行上述蛋白质的分离。用于层析柱的憐酸钠缓冲液是采用无水磷酸钠配制的，且进行了 4 个程序的循环以尽量降低 PR 的影响 (图
24.1)。PPi 有助于 ha
对蛋白质的层析分离，尤其是对于一些弱吸附的蛋白质。然而，我们还必须谨慎操作，保证在所有的实验间高阶磷酸盐的水平均保持一致，以避免人为失误。
多次使用后，金属物质的累积会导致层析柱褪色。褪色原因可见于牙齿研究者对龋齿的研究、医学研究者对骨骼完整性研究和组织液处理人造骨骼或尸体植入 (cadaverimplant) 的研究以及材料科学家对土壤污染物和金属吸附的检测。
依据 Shepard 等 (2000) 的研究，在进行若干个重组蛋白纯化循环后, 陶瓷化 HA 层析柱会发生褪色。其层析工艺中，陶瓷化 HA 柱层析是继阳离子交换和阴离子交换层析之后的第 3 个步层析。他们得出的结论是，使陶瓷化 HA 褪色的金属物质有多种来源: 工艺用设备、试剂、水及发酵营养物。然而，层析柱褪色不会影响它们对于重组蛋白的纯化。
农学家解释为 HA 会优先吸附多价金属（Maetal.，1 即 4)，并且证实 HA 对二价重金属具有高吸附力。在陶瓷化 HA 层析柱褪色的过程中可以观察到很多这种金属物质，尤其是 Fe、Al、Zn 和 Mn。
层析过程中会使用大量的缓冲液,
这会使层析柱的顶端产生空隙或者在 HA 中形成通道。HA 的溶解度常量为 2.4XKT59，相当于约 4ppm。磷酸根离子和碱性 pH 抑制
HA 的溶解。然而,HA 可以从非常稀的溶液中吸附蛋白质, 如 Immol/L(pH6.8) 磷酸盐缓冲液，并且可以是无缓冲能力的碱性金属溶液,
通常为 Immol/L 的 NaCl、KCl 或两性离子缓冲液。Schirch 等（W85) 证实某些酸性蛋白质仅在水中被吸附。正如
Scopes(1993) 所解释的，较低的无缓冲载荷条件可降低对 HA 表面 pH 的控制。研究者们 (Schroderetal.，2003)
指出，可以在磷酸盐缓冲液中使用 4-X#氧氮己环丙磺酸 (4-morpholinepropanesulfonicacid，MES)
来保持磷酸盐洗脱，同时还能够维持上样缓冲液和洗脱缓冲液的 pH。然而，即使使用磷酸盐抑制 HA 的溶解，但其溶解性仍是一个危险因素。例如，采用
2*0 mmol/L、pH6.5 的磷酸钠平衡层析柱，并用平衡缓冲液上样，继而在 20 mmol/L 磷酸钠缓冲液中增加 NaCl
浓度进行连续洗脱。如此不断循环后，层析柱中会形成空隙并且压力增加。这些空隙和产生的压力是由于 HA 受到了化学损伤，这主要是 HA
表面积累的水合氢离子的解离导致的。图 24.3 所示为流出液的 PH 变化以及水合氢离子吸附 (A 和 B) 和解吸附吸附 (C 和 D)
区域。
Harding 等（2005) 认为水合氢离子的吸附与解吸附是 HA 电荷零点（zeropointcharge) 发挥作用。并且研究 (SkartsilaandSpanos,2007) 证明了电荷零点、pH、水合氢离子吸附与解吸附和钙离子含量间的关系。Skartsila 和 Spanos 所测得的电荷零点并不一致，分别为 7.3±0.1 和 6.5±0.2。这些研究同时还解释了输人缓冲液的 pH 与柱后流出液 pH 偏差间的区别。可以如此合理假设: 改变输入缓冲液的 PH 或提高其缓冲能力，能够降低 pH 变化的强度，同时也可能缩短该变化所持续的时间。然而，先前已经提到，当磷酸盐的浓度太髙时，有些蛋白质无法吸附于 HA。如一些工艺开发工程师指出的，在某些情况下，即使 5 mmol/L 的磷酸盐都能够抑制蛋白质的吸附 (McCueetal.，2007)。
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