选择合适的缓冲液可以有助于保持目标蛋白质的完整性，同时利于其吸附于
HA。这一步骤在平衡时最好已经完成，平衡时应该没有任何的磷酸盐，然后加载缓冲液。但是在经过几个循环后，填充柱便失效了。研究表明，低至
2rmnol/L 的磷酸盐可以延长层析柱的寿命，同时又兼顾目标蛋白质的纯度。磷酸盐与 MES 或与 3-(N-吗啉代）丙磺酸 (MOPS)
及少量的钙离子联合使用，可充分抑制 HA 的溶解。这些工艺开发工程师并没有明确地提到 pH 转换 (McCueetal.，2007)。图 214
所示为采用 MES 缓冲液的优点, 可以将图 24.3 中所观察到的 pH 变化及其持续时间最小化。两种系统缓冲液的含高浓度 NaCl
的洗脱组分中均可以检测到钙离子。对于 0~02mol/L 磷酸钠缓冲液，钙离子浓度为 36ppm; 对于 75
mmol/LMES/0.02mol/L 的憐酸盐缓冲液，耗离子浓度为 5ppm。
大多数蛋白质能在具有较低离子强度的、浓度低至 I_ol/L 的磷酸盐缓冲液中吸附于 HA。对于已经吸附的蛋白质, 通常采用含有 NaCl 或 KCl(盐）的高浓度磷酸盐洗脱。用其他类型解吸附溶液洗脱蛋白质并不常见。
如果蛋白质样品中含有大量的盐，那么可以对其进行足够地稀释，但磷酸盐的浓度不得低于 Immol/L, 以保证样品能吸附于 HA。如应用其他缓冲液，其浓度应足以控制 pH。首先以线性盐梯度进行洗脱，检测蛋白质是否能够解吸附。若蛋白质仍结合于层析柱，那么可以采用线性磷酸盐梯度作为洗脱液进行重复操作。检测蛋白质的纯度，确定洗脱蛋白质所需盐浓度或磷酸盐浓度，并将其用于纯化方案中的洗脱步骤。比较分步洗脱和梯度洗脱所得蛋白质的纯度。需要时可依此调整纯化方案。如果需要将其他类型的结合蛋白质和生物组分与层析柱解吸附，可以先采用 3 个柱体积的、不含其他盐类的、低离子强度 (LIS) 的磷酸盐进行清洗，再以 3~5 个柱体积的、0.5mol/LpH7 的磷酸盐缓冲液，3 个柱体积的、LIS 缓冲液以及 3~5 个柱体积的 0.5~1mol/LNaOH 进行清洗。准备用于下一轮分离的层析柱时，可以先釆用 3 个柱体积的 LIS 缓冲液，再以 3 个柱体积的、pH 与平衡缓冲液一致的、0.5mol/L 磷酸盐缓冲液清洗层析柱，最后加载 3 个柱体积的上样缓冲液。
实验室规模 HA 层析柱的填装方案因 HA 的来源不同而异。填装 HAUltrogel 吸附剂时采用的层析柱，其髙/径比值为 1~6，直径为 1.6~5.0 cm。准备填装用吸附剂时，应采用温和地翻转容器或者塑料搅拌器搅动的方式。将适当体积的吸附剂浆液倒入真空容器中，且后者的体积应约为目的填装层析柱体积的 2 倍。然后，向其中另外加入约 40% 的水稀释浆液。轻轻混合后, 连接真空泵除去其中未溶解的空气。再缓慢地搅拌已脱气的吸附剂，以获得均匀的悬浮液。再一次性地将其倒人层析柱中，尽量不要使空气进入浆液流中。待悬浮液沉降 5~10 min，直至层析柱顶端出现 Icm 清晰可见的清液层。
再将人口适配器插人层析柱中，并与液相层析设备相连，继而采用水或者平衡缓冲液，以流速为 55~250 cm/h 运行, 具体流速取决于所需填充床的高度; 对于 20 cm 髙的填充床可用 55 cm/h 的流速,5 cm 髙的填充床则用 250 cm/h 的流速。调整人口适配器的位置, 使其接触填充床的表面，进而排除截留的空气。若有空气突然侵入层析柱中，须按照上述步骤重新进行填装。
CHT 是一种球状的多孔陶瓷化介质。可与之相配的层析柱包括带有可变高度适配器的 MilliporeVantageL 和 WatersAP，额定压力在 3bar 以上。可根据填充床的尺寸及 CHT 的密度计算所需 CHT 的重量。例如，一个 I.Icm 内径 X20.0 cm 髙度的填充柱，其体积为 19 mL，需装入 12 gCHT。用塑料搅拌器将 CHT 悬浮于 3.5 倍体积的填充缓冲液 (0.2mol/LNa2P047 H20,pH9~10) 中。选择的填充缓冲液，应至少具有 0.Imol/L 的离子强度并至少含有浓度为 20 mmol/L 的缓冲组分，pH 为 6.8~10。静置悬浮液，使封闭于填料颗粒中的空气分离出来。将填充延长管连接于层析柱，这样便可以一步处理所有悬浮的陶瓷状 HA。向层析柱/延长装置中灌入填装缓冲液, 并使其高度达到 1~2 cm。用塑料搅拌器搅拌烧杯中的填料颗粒使其悬浮，再倒入到层析柱/延长装置中。用填充缓冲液清洗剩余的陶瓷化 HA，再倒人层析柱/延长装置中。打开层析柱的出口，通过重力流动作用填装陶瓷化 HA，直至高度恒定。关闭层析柱的出口，移走延长管, 然后插入入口适配器，使其降低至正好能够接触到重力作用填装的陶瓷化 HA 表面。再将其与液相层析设备相连, 打开层析柱的出口, 用 3 个柱体积的填充缓冲液，以 250 cm/h 的流速平衡填充的陶瓷化 HA。调整适配器的位置，使其刚好可以接触到因上述流动后所产生的陶瓷状 HA 表面。若有空气突然侵人到填充床中，通常可以在层析柱的调节步骤中将其排除。层析柱的调节步骤: 先采用 3 个柱体积的平衡缓冲液, 再以 3 个柱体积的 0.5~Imol/LNaOH、3 个柱体积的 0.4~0.5mol/L 的磷酸钠缓冲液 (pH6.5~7.2) 和 3 个柱体积的平衡缓冲液处理层析柱, 使其适应新的环境。平衡缓冲液一般为离子强度较低的缓冲液，如 2~20 mm0l/L 的磷酸盐，当磷酸盐的浓度为 2~10 mmol/L 时, 需向其中加入 GoocPs 缓冲液。
微晶型 HA 可以从不同的公司购买到。将 Bio~GelHTP 和 HT 填充至层析柱之前，须进行相关的准备工作。缓慢地倾出 HT 的上清液后，加入等体积的填充缓冲液。通过旋转容器悬浮 HT，将 2 倍于所需灌装层析柱体积的悬浮液倒入烧杯中。沉淀悬浮液 30 min，再轻轻倒出上清液，其中可能含有细微颗粒。对于 HTP，每 2.5 mL 目标填装体积对应 Ig 干粉。将粉末放置于烧杯中，容器体积应为目标填装体积的 2~6 倍，并用塑料搅拌棒缓慢将其混合。沉淀悬浮液 30 min，再轻轻倒出上清液，其中可能含有细微颗粒。加人与目标填充体积相当的填充缓冲液，得到 50%(V/V) 悬浮液。用塑料搅拌棒轻轻搅拌以悬浮 HT 或 HTP。以漏斗或层析柱延长装置将所有的悬浮液灌注到层析柱中。10 min 后, 打开层析柱的排出口，通过重力流作用灌装层析柱。不要让空气突然侵人填充床中。当层析柱顶端剩余约 2 cm 缓冲液时，关闭排出口，移走延长管或漏斗, 再插入入口适配器，使其下降以排除其接入通路产生的空气。继续降低适配器的位置，直至其恰好接触到重力形成的填充床表面。若采用 DNAGradeBio-GelHTP，准备工作和填装均与 HTP 相似。HT 和 HTP 的最大流速为 100 cm/h;DNAGradeBio-GelHTP 的最大流速为 40 cm/h。对于 CalbiochemHydroxylapatiteFast；Flow 及其高分辨率层析柱的预处理及填装分别与 HTP 和 DNAGradeBkKielHTP 相似。Clarkson 公司的陶瓷化 HA 与 HypatiteC 的预处理及填装也与 HTP 和 HT 相似。
HA 的供应商通常不会列出全部的 HA 产品目录。表 24.2 所列为 HA 和陶瓷化 HA 目前的一些供应商。
首页
