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慢病毒包装实验

2020.8.17
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

实验材料 病毒

试剂、试剂盒 无血清培养基脂质体胰酶含血清的培养基DMEM

仪器、耗材 EP管6孔板CO2培养箱高速离心机-80°C冰箱

实验步骤

以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×106个293T细胞。

 

1. 取1.5ml灭菌EP管,加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀,室温孵育5min。

 

2. 取1.5ml灭菌EP管,取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。

 

3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min

 

4. 用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

 

5. 在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。

 

6. 将1ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。

 

7. 移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。

 

8. 转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min,去除沉淀。

 

9. 病毒上清-80°C贮存。

 

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。




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