包涵体蛋白溶解后的重折叠实验（二）

二、对该常规操作流程的评论

1. 大肠杆菌中重组蛋白的过表达

获得高水平表达与重折叠是不同的主题，在此不会进一步讨论(可见本部分的第12章 )。许多系统可以获得占总细胞蛋白质1 0 % 〜4 0 % 的目标蛋白质表达水平(Mak r i d e s，1996; M u r b y et al.， 1996; Sorensen and M o r t e n s e n， 2005; Studier et al,， 1990)(见本章 第 9 节）。通常 ，研究者需要做实验以确定在什么温度下培养细胞、使用多少诱导剂以及诱导多长时间。当目标蛋白质实现髙水平的诱导表达后, 通常会将细胞离心，然后冻存于一80°C 待用。有些说法认为，将细胞冻存数周会使得包涵体难以重折叠，但据我的经验 ，我们可以使用冻存了数月的细胞做出很好的重折叠效果。然而遗憾的是, 据我所知，
尚无系统的研究探讨这一问题。

2. 包涵体的洗涤

我 们 最 初 用 2 % 的 去 氧 胆 酸 钠（sodium deoxycholate)洗 涤 包 涵 体（Burgess andKrmth， 1996; N g u y e n e t a l ., 1993) ，但后来发现1% 的 Triton X-100效果更好、使用更方便 。强 烈 推荐大家使用我称为「美食家」（g o u r m e t) 的 Triton X-100[Pierce,Surfact A m p s X -100, 1 0 % (m /V )溶液], 其经过纯化除去有时会在旧的淡黄色瓶子里保存的T r i t o n X -I O O 中发现的过氧化物后，保存在密封于安瓶瓶(am p o u l e) 的氮气中。可以尝试用不同的盐和去污剂作用以观察哪一种能够更有效地洗出包涵体中的杂质，而同时又不会溶解目标蛋白质，有时候也可以用1〜2 m d /L 的尿素洗涤。一般来说，在溶解包涵体之前，需要洗掉尽可能多的膜成分、D N A 及其他蛋白质。

3. 包涵体的溶解

如之前所说，有 些 包 涵 体 蛋 白 接 近 天 然 状 态 ，用 温 和 的 条 件 ，如 非 离 子 去 污 剂(nonionic detergent)或者甚至 0•5 m o l / L N a C l 就可以将其溶解（V e r a et al.， 2006)。大多数情况下，这种做法是不行的，而是需要使用更强烈的变性条件。

与前面的裂解缓冲液一样，促溶剂/变性剂（solubilizing agent/denaturant) —般溶于缓冲液中，以控制 p H 、螯合重金属以及维持还原的环境。通常 ，用促溶剂重悬包涵体, 孵育 30〜60 min，然后离心除去不溶的物质。由于包涵体中的蛋 白 质 至少是部分变性的，所以溶解可在室温下操作，有时甚至需要给溶液加热以实现完全溶解。例如，当把天然的
绿色突光蛋白（green fluorescent protein，GFP)溶 于 6 m ol/L 盐 酸 胍 时 ，在室温下其仍然具有荧光，但 在 75°C条 件 下 ，其 会 在 I mi r i以 内 变 性 并 失 去 荧 光（R. Burgess和 N.T h o m p s o n ，未 发 表 的 结 果）。 对 促 溶 作 用 更 详 细 的 论 述 可 参 考 Marston和 Hartley(1990) 的文献。

下面是对几种促溶剂使用上的评论。

(1)盐 酸 胍 它 可 能 是 最 常 用 的 促 溶 剂 ，通常 其 在 相 容 缓 冲 液 中 的 使 用 浓 度 为6 m o l /L 。在这种强的离液剂中 (chaotropicagent)，大部分蛋白质会迅速变性，但许多时候在较高温度下孵育会有助于实现蛋白质完全变性。一旦溶解后，稀 释 至 3 m o l /L 盐酸胍通常也没有问题, 因为从变性状态到天然状态的变化通常发生于1〜2 m o l /L 盐酸胍的水平 (P a c e, 1986)。通常稀释至约0.1 m 〇l/L 盐酸胍就可以实现足够低的盐水平，以保证重折叠的目标蛋白质结合于离子交换层析柱 (见下文)。

(2) 尿 素 8 m o l / L 尿素是常用的促溶剂，尤其用于在变性状态下进一步纯化目标蛋白质( K r m t h and Burgess, 1987)。 一 般 8 m o l / L 尿素在促进蛋白质溶解和使蛋白质完全变性方面不如 6 m o l / L 盐酸胍那么有效。必须注意到总是存在于尿素溶液中的氰酸盐(cyanate) 可能引起蛋白质的氨甲酰化(carbamylation)(本 书 第 4 4 章对如何尽量降低尿素中的氰酸盐提出了建议)。

(3) 十二烷基肌氨酸钠或十二烷基磺酸钠（sarkosyl或 S D S ) 研究者发现, 十二烷基 肌 氨 酸 钠 作 为 有 效 的 促 溶 剂 ，能 够 帮 助 蛋 白 质 在 更 高 的 浓 度 下 重 折 叠（Burgess，1996)。十二烷基肌氨酸钠是一种很强的阴离子变性剂, 很像S D S ，但其与蛋白质结合得更 弱 ，比 S D S 更易解离。通常包涵体可以溶解于0. 3% 的十二焼基肌氨酸钠, 但必须注意的是不能用十二烷基肌氨酸钠溶解等于或超过自身重量的蛋白质。例 如 , 如果你要溶解含 有 150 m g 目标蛋白质的洗涤过的包涵体, 用20 m L 0. 3 % 的十二烷基肌氨酸钠(60 m g十二烷基肌氨酸钠)不能溶解完全。你必须加人至少50 m L 0•3 % 的或者30 m L 0. 5 % 的十二烷基肌氨酸钠。

我们注意到, 如果在包涵体中存在许多Triton X -100，那么需要更多的十二烷基肌氨酸钠来溶解目标蛋白质。几乎可以确定，其 原 因 是 Triton X -100可以形成大的微团, 并且可以吸收一些十二烷基肌氨酸钠形成混合微团，而微团是没有促溶解作用的。

如 果 将 0. 3% 的十二烧基肌氨酸钠溶解的目标蛋白质稀释至约0•01 % 的十二焼基肌氨酸钠, 大部分十二烷基肌氨酸钠就会从蛋白质上解离下来, 蛋白质就会重折叠。残余的去污剂似乎是与部分重折叠的蛋白质的疏水区(黏性位点)结合，从而阻止聚集作用。其就 如 同 化 学 伴 侣（chemical chaperone)— 般 发 挥 作 用 。如 果 你 的 目 标 蛋 白 质 能 够 和P O R O S H S 之类的阳离子交换柱(cation-exchange c o l u m n)结合, 那么稀释后的溶液可以经过过滤，然后泵人1〇 m L 的柱子，用 10〜2 0 个柱体 积 的 0.1 m o l /L 的 N a C l 缓冲液冲洗 ，然后用盐浓度梯度洗脱(见 本 章 5. 5 节），目标蛋白质将会结合在柱上，而游离的十二焼基肌氨酸钠则会流穿，结合在蛋白质上的残余的十二烷基肌氨酸钠也会在长时间冲洗中解离。对洗脱蛋白质的实验分析表明，蛋白质中基本上没有(10个蛋白质分子中少于1个十二院基肌氨酸钠分子)残余的十二烷基肌氨酸钠（R . B u rgess, 未发表数据）。不要
用 M o n o S 柱做此工作，因为十二烷基肌氨酸钠会同该柱子结合，并损坏柱子，而且会污染你的洗脱蛋白质。

SDS也可以以类似的方式使用，但必须注意的是，使 用 的 SDS不能含有长的链烷烃(alkane)，如 C14、C1 6 等 。用 在 S D S 中 变 性 的 G E P进 行 的 重 折 叠 实 验 效 果 很 好（R.Burgess、N. Thompson和 R. Chumanov, 未发表数据），因此应该考虑使用SDS作为有效的促溶剂。

已有相关文献报道利用阳离子变性剂氯化十六烷基三甲基铵(cetyltrimethylammo-nium chloride，CTAC)成功实现了蛋白质的促丨谷和重折叠 (Puriet al.，1992)。 即使是盐浓度非常低的蒸馏水也能取得促溶效果(S o n g ， 2009)。

4. 重折叠

假设你已经按如下方法进行了重折叠实验，那么最基本的稀释变性剂的方法就是将溶解的蛋白质稀释入合适的重折叠缓冲液中。然而，这 里 有 3 种方法可用于重折叠稀释。

(1) 反向稀释(reverse dilution) 将重折叠缓冲液加至变性蛋白质中，每次加时都要混 匀 。该方法已有数个成功的例子[如G r i b s k o v和 B u r g eSS(1983)]。然 而 ，仔细想想就会知道，这种稀释方法无疑会在蛋白质开始重折叠的关键时期产生最髙的蛋白质浓度。例 如 ，如果蛋白质以I m g /m L 的浓度溶解于6 m o l /L 盐酸胍，那么如果加入2〜5 体积的重折叠缓冲液(稀 释 至 1〜2 m o l / L 盐酸胍），就可能会在蛋白质浓度为 330〜160 ug/mL时经历重折叠的过渡状态。

(2) 瞬间稀释（flash dilution) 将变 性 蛋 白 质 快 速 加 入 重 折 叠 缓 冲 液 。例 如 ，将10 m L 6 m o l /L 盐酸胍中的重折叠蛋白质一次性加入590 m L 的合适的重折叠缓冲液中以稀释60倍, 同时快速混匀。在重折叠时, 蛋白质浓度会成为16ug/m L ，远低于反向稀释的水平，导致蛋白质聚集的可能性较小。

(3) 滴注稀释(drip dilution) — 滴一滴地非常缓慢地将变性蛋白质滴人重折叠缓冲液中，滴加需要 I h 。理论上, 这应当是最佳的方法，因为蛋白质总是在极低的浓度下进行重折叠[参见S i n g h 和 P a n d a (2005) ,Vallejo和 Rinas(2004)的综述]。例如，如果你将 0.1 m L 上述溶解的蛋白质滴入590 m L 重折叠缓冲液中，那么蛋白质浓度只有〇.16ug/m L。因为你滴入的样品量增加得很少，所以蛋白质总是保持在低浓度, 而且当最后一滴被加人时，蛋白质浓度为16ug/m L。然而 ，如果变性蛋白质经过了 I h 的滴加，而且蛋白质有效地重折叠至天然状态的半数重折叠时间只有1〜3 m i n ，那么部分重折叠的黏性蛋白的浓度总是很低，因而它们就不会发生聚集。耗 费 i h ，一滴一滴加人溶解蛋白，这会让人感到厌烦，但可以使用设置为极低流速的蠕动泵将变性蛋白质在I h 这段时间内加人。这样做的重复性更好，而且显著减少了研究生的精力消耗。
蛋白质稀释后将其静置30〜60 m in，然后按常规流程中介绍的那样进行过滤。否则 ，当将蛋白质溶液上样至柱子 (见下文)时，非常小的颗粒状的物质就可能会堵塞柱子，引起压力升高，从而使实验中途失败，或是需要将流速降得很低以至于上样就要花费数小时。