范可尼贫血（先天性骨髓发育不全）的诊断——二氧桥丁烷（双环氧丁烷）检测实验
实验材料 外周血
试剂、试剂盒 RPMI 15% FBS 完全培养基二氧桥丁烷秋水仙胺KCl固定剂
仪器、耗材 注射器组织培养瓶离心管离心机倒置显微镜
实验步骤
1.从配有 18 1/2 G 针头的 10ml 注射器中滴入外周血（18~25 滴；0.4~0.5 ml) 至已盛有 10ml RPMI/15% FBS 完全培养基的 25 cm2 组织培养瓶中。配置两份培养基为 DEB 研究，两份作为未处理对照（共 4 份）。孵化培养基 24 h(附录 31)。
2.分装 PBS 至 3 个 15 ml 离心管中：第 1 管 10 ml，第 2 管 6 ml，第 3 管 4.5 ml。
3.在加培养基之前，先加 10 ul 常用的 DEB 至第 1 管，加盖，混匀。从第 1 管中转移 4 ml 至第 2 管，加盖，混匀。从第 2 管中转移 0.5 ml(500ul) 至第 3 管，加盖，混勻。
4.从第 3 管中各取 25 u1 溶液加入两个已孵化了 24 h 的外周血培养基中（从第 1 步；培养瓶中的最终浓度为0.l ug/ml。）。再孵化 48~72 h。
5.每 10ml 培养基中各加人 1ul/ml 的秋水仙胺 2 ml，孵化 20 min。
6.将每个培养基培养瓶中的液体转移到 15 ml 圆锥形底部的离心管中，加盖，150 g 离心 10min。
7.去掉大部分上清液，用手指轻弹离心管，使剩余上清中的片状沉淀物重新处于悬浮状态，小心地加人预热的 0.075mol/L Ka5 ml，使细胞膨胀，但不要使其破裂。在 37°C 水浴槽中孵化 10 min。室温，150 g 离心 10 min。
8.去掉上清，轻轻地加入 1 ml 新鲜的固定剂，不要把沉淀冲起来。去掉固定剂，重复这一步。
9.立即用食指弹击管壁几次，使片状沉淀物碎裂。迅速加入固定剂使细胞悬浮，防止其成块。终体积为 8~10ml。用 Pasteur 移液管打散团块。室温静置 30 min。
10.室温，150 g 离心 lOmin。去掉上清，留下 3~5 ml，使片状沉淀物悬浮。室温静置 lOmin。可立即重复这一步一次或两次，也可以让固定剂中的细胞在室温下过夜以后进行。
11.室温，150 g 离心 lOmin。去掉上清，打散沉淀，加入适量的固定剂（0.25~0.5 ml)，使其达到一个理想的浓度用于制片。
一个理想的细胞浓度能使绝大部分细胞在一个显微视野中，没有拥挤的中期伸展。
12.从一个适当的高度，滴下几滴细胞悬液于清洁的玻片上，使中期分裂相能很好地散布（单元 4.1)，一瓶培养基最少要制作 6 块玻片（推荐使用非诊断用的细胞去练习)。
这一步是成功的关键。
13.在倒置显微镜下观测玻片，确定中期分裂相的质量和数量。用吉姆萨将玻片染色 (支持方案 2)。
14.每一个 DEB 处理的标本分析 50~100 个用吉姆萨染色的中期分裂相（对于高度断裂的情况分析 25 个中期分裂相；附录 3K)。对染色体进行计数，并记录结构异常的染色体的数目和类型。如果断裂的染色体超过了上面的正常范围，分析未处理的标本。分析完成后对异常的细胞进行照相。
15.根据已出版的结果作为基础和 PHA 刺激下，夕卜周血淋巴细胞中 DEB 诱导染色体断裂情况下解释结果。
表 8.7.1 显示了从正常和受影响的个体中得到的基线和处理培养数据
支持方案 1 二氧桥丁烷的使用和处理
DEB(1，3-双环氧丁烷）为潜在的致癌物质，处理这种化合物时，必须采取一些防范措施。这一部分阐述的是如何使用和恰当地处理废物。
工作空间。凡用到 DEB 的操作必须在化学通风橱或者 n 级生物学安全工作橱中完成。在使用 DEB 时要穿实验工作服和戴手套。手上随时准备一瓶 6mol/L HCl(50 ml)，一旦 DEB 不小心倒出来马上将其灭活。
细胞培养。有 DEB 参与的细胞培养操作应该在 n 级生物学安全工作橱中完成。细胞被固定后，操作就可以在安全橱外进行了。用 6mol/LHCl 处理废弃的培养基和清洗液，并视其为危险生物废物。以前使用过的移液管和培养瓶应该用 6mol/L HCl 冲洗，并放在高压危险生物袋中。微量移液吸头也应该丢在盛有 6mol/L HCl 的小瓶内。
废物处理。DEB 原液应该当作危险的化学废物来处理，而不能采用稀释或化学灭活的方法。使用过的塑料器具应该用 6md/LHCl 冲洗并丢入高压危险生物袋中。培养基和清洗液也应该用 6mol/LHCl 处理，并作为危险生物废物来处置。
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