使用 TAQMAN 分析法的高通量基因分型实验

实验材料 基因组DNA

试剂、试剂盒 PCR 混合液

仪器、耗材 96孔透明板和盖子水平离心机ABI PRISM 7700 测序系统热循环仪统计软件包

实验步骤

1.96孔透明板B到H行每孔加2ul (30ng）基因组DNA，保留A行作对照—其中4孔只加2ul缓冲液作为「无 DNA」对照，余下8孔每孔加24基因组DNA作为阳性对照，两种纯合子各加4孔。

2.每孔加23ul PCR混合液，盖上透明盖，在水平离心机上短暂离心，用ABI PRISM 7700测序仪得到一个PCR反应前荧光读数。使用「PlateRead」形式，确保选中Use Spectral Compensation forEndpoint 项（在Advanced Optionsinthe Instrument and Diagnostics菜单下）。

3.用下面的条件在热循环仪上开始PCR。

1个循环：2 min 50°C

1个循环：10min 95°C(变性）

40个循环：15s 94°C(变性)

1 min 62°C(复性/延伸)

最终步骤：无限4°C(维持）

4.再次读取荧光得到一个PCR反应后读数。如果使用ABI PRISM 7700提供的等位基因分析（allele-calling)软件，选用「AUelicDiscrimination」模式读取焚光，通过算法可以自动分出基因型或通过视觉检查进行基因分型。

如果进行大规模基因分型（如样本数>500)，将多个孔板的样本数据集中起来确定基因型显得更为准确。这样，请遵照本方案中的剩余步骤。