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实验步骤
3.1 实验设计
1. 平行设计
不同凝胶之间部分蛋白质点的量变是不可控的。重复样品之间或从蛋白质样品制备到二维凝胶染色的任何步骤的生物学差异，都是这些不可控变化的原因。已经表明，批次效应（即不同系列同时运行电泳和染色的二维凝胶的变化）对二维电泳的结果影响很大，因此在实验设计中考虑这些影响很重要。多个批次时须将胶分组 ，只不同于分析因素，举例来说，在同一电泳槽中比较 12 个处理（每处理重复 3 次），其中 12 块凝胶可以同时运行，3 个二维系列应随后运行，每个处理应在一块凝胶的一个系列上表示。因此， 一旦不受控制的变化影响到 3 个系列中的一个 ( 如一银染比在其他稍暗），它们会以同样的方式影响到所有的处理。与此相反，如果 3 个重复中的 4 个处理在同一个电泳槽上运作，将无法解释这些处理的批次效应和真正的生物学效应之间的关系。在现实中，并不总是能够建立完全平行的设计，因为失败的二维凝胶必须进行第二次实验。不过，可以用补充批次的办法来尽可能平衡实验。
值得注意的是，批次效应的放大可以通过事后运行主成分分析（将凝胶作为观察值和将点作为变量）实现可视化。
2. 技术和生物学重复
重复对检查定量变化极为重要。它们考虑到那些不可控制的变量，而这些不可控制的变化对于评价被研究因素的效果必不可少。
当使用生物学重复时（来源于不同的植物样本），重复之间的差异是由于生物学和实验上的差异造成的。当然，当使用实验重复时（如来源于同样的蛋白质样本的不同凝胶）时，只考虑实验中的变量。因而实验重复产生的差异一定比生物学重复中产生的要小，在统计测试中从而更加显著。不过，从实验得出的结论可能只适用于该研究样本，因为不好确定差异来源：它可以由单植物的不同造成（如环境和发育的变化），或由在制备样本过程中技术的变化，以及所测试的因素所引起。相反，当运用生物学重复时，研究的因素是唯一可能产生显著差异的原因，因为只有它在对比组和鉴定组之间产生差异；因此，当所研究的处理是一个定性变量时（如干旱与对照）就必须使用生物学重复。
当研究的因素是一个连续变量（如同样试剂的不同剂量，或相同处理不同时间）时 ，完全没有必要为所有测试值（ 剂量或时间点）进行重复：统计检验（如线性回归）将根据观测值和该预测值之间的差值计算剩余变量。不过，重复只有在以下两种情况下可以省略：① 有充足的数据点（一条回归线只有 3 点是不充分的）；② 蛋白质量和剂量或时间之间的关系是线性的（线性回归），或预期的线性图形是已经知道的（非线性回归)。
在某些情况下有可能使用连续数据之间的同质性（ 如 3 个时间点）来解释没有生物学重复的实验结果：在连续时间点的响应，它的连贯性或连续性支持变量与处理相关的假设。相反，打破连续性反应的值将被视为可能由个体差异造成。因此，连续的值实际被用来作为生物学重复。不过实际上在所研究处理的分析中，这样做将导致分辨率的丢失。
为了减小个体差异而考虑生物学变异的最好方法是在生物学重复中多取几株植物。
3. 参考凝胶
即使在定量分析时参考凝胶也不一定使用，但它一般是有用的。在大多数的二维软件包中，点匹配是基于建立一个包含所有匹配点的虚拟参考凝胶。建立这样一个参考凝胶是一个限制步骤，最好是一开始就建立一个已经包含几乎所有点的真正凝胶。可以通过运行共电泳的方法来实现，在电泳中不同的处理由等量的蛋白质代表。
3.2 图像采集
1. 数字化
图像数字化是定量分析的第一步。凝胶可用激光密度仪，平板扫描仪（如 Pharmacia) 或 CCD 相机 （如 ProXpress) 扫描。
无论何种系统必须先获取传输值，也就是说，探测器接收从凝胶反射的光。传输值是探测器在凝胶存在的情况下接收信号的强度和在没有凝胶存在情况下接收信号强度之间的比率（I/I0）。当然，当使用一个平板扫描仪时，任何使对比度增强的功能（如伽马校正）都不应被激活，因为它们会扭曲真正的传输值。传输值（范围从 0 到 1) 一般编码成 16 比特位，也就是说，I/I0 的比率转化成 0~65735 不等的值。因此，产生的图像是一个介于 0~65735 数值（像素）的矩阵。普遍采用灰度模式的 TIF 格式，不使用像素失真如 JPEG 格式压缩的。
2. 图像分辨率
分辨率（每长度单位多少像素）越高，小点将被检测和量化得越好。不过分辨率在检测有重叠点的群体中也是一个制约因素。
如果强度峰值之间没有“ 波谷” ，多数二维软件包是不能探测同一组中的多个点的。因此，点检测的准确性取决于能否发现这些“ 波谷”，而这又取决于代表两点之间强度变量像素的数量。约 24 cm X 20 cm 的凝胶，一般用每像素 100 μm 的分辨率，近似于 300 dpi ( 每像素 84.7 μm) 。这个值实际上是一种折衷的选择，因为两个因素限制了图像分辨率：① 图像采集速度：当众多的凝胶必须同一天扫描时，扫描凝胶所花时间成为限制因素；② 图像文件的大小：用分辨率为 100 μm/ 像素和 16 位数字化对约 24 cm X 20 cm 凝胶扫描，产生的文件为 10~14 Mb。图像文件越大，二维套装软件检测、量化并匹配点所需要的时间越长（见注释 1)。
3. 动态图像
在图像采集过程中，应尽可能充分使用 65736 灰度级。视扫描仪的类型，可调整曝光时间、光圈大小、使用过滤镜与否。凝胶图像不应含有白色表面（100% 传输）：如果背景未检出，背景水平面上的小点也可能将不会被检出。
图像也不应该包含黑区域（0% 传输），因为比阈值更黑的所有点将被编码成相同的值。
免费软件 ImageJ 可以用来寻找这些饱和值的可能区域。它还能检查动态图像，即图像上最小和最大值之间的差值。图像动态应最大化：当然精确的量化取决于图像采集中使用的灰度水平。如果用几百灰度水平处理 65000 以上的图片无疑是不恰当的。
当使用相机时，光可以产生光晕：即边缘区域的图像比中央区域要黑。有的图像采集系统（如 ProXpress、Perkin) 设计时本身已顾及光晕。当然，这种现象也可以通过背景消除法消除。
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