3. 糖基释放后的蛋白质分析
1 ) 糖基释放的化学处理方法
还原性氨化反可应选择性的解离糖蛋白上的 O-糖苷（见注释 10) 。去糖基化的蛋白用 1D SDS-PAGE 分析，将其迁移情况与其糖基化形式的蛋白进行比较，电泳迁移率的增加是 O-连糖苷出现在蛋白上的证据（见注释 11)。
( 1 ) 将 1 mg 纯化的蛋白样品放入带聚四氟乙烯涂层的螺旋盖子的玻璃管中，进行冻干处理。
( 2 ) 将干燥样品溶解于 500 μl 硼氢化钠溶液中，盖紧玻璃管，37°C 过夜放置。
( 3 ) 逐滴添加乙酸来终止还原性氨化反应，直至无气体产生。再加入 500 μl 的 10% 乙酸甲醇溶液。在通风橱内风干。重复洗涤过程 3 次以洗去剩余的硼酸盐。
( 4 ) 去糖基化处理后，去糖基化蛋白用 4 倍体积的乙醇于 -20°C 过夜沉淀处理，用合适的缓冲液溶解沉淀物用于 1D SDS-PAGE。同时可回收乙醇相中的糖苷，用于单糖组分分析（见 25. 3.2 节 2) 。
2) N-或 O-糖苷酶的酶促处理
用糖苷酶处理纯化获得的糖蛋白可得到进一步的信息。内切糖苷酶 H ( Endo H ) 只能通过水解 N-糖苷中心的两个 GlcNAc 残基之间的糖苷键，来解离植物糖蛋白中的高甘露糖型的 N-糖苷（图 25-3)。多肽 N-糖苷酶（ PNGase) 通过水解位于肽链骨架天冬酰胺和寡聚糖近端 GlcNAc 之间的键，解离高甘露糖 N-糖苷和复合 N-糖苷。PNGaseF，一种被广泛应用于哺乳动物糖蛋白分析的 N-糖苷酶，可解离高甘露糖 N- 糖苷和复合 N-糖苷，但不能水解与邻近 GlcNAc 连接的 α-1-3-岩藻糖残基。PNGaseA 可解离所有类型的植物糖苷（图 25-3)，但它几乎只对糖肽起作用，所以需要在去糖基化之前酶解糖蛋白 [23，24] 。糖蛋白或肽的去糖基化分析方法有：①电泳迁移的增加；② Endo H 或 PNGaseF 处理后，糖蛋白对糖苷特异性探针免疫活性的丧失；③ EndoH、 PNGase F 或 PNGase A 处理后的质谱分析。对于 O-糖苷酶可以采用同样的手段和方法，但是我们实验室很少用，因此不在此详述（详情见参考文献 25 和 26)。
内切糖苷酶 H 去糖基化。
( 1 ) 在用 EndoH 去糖基化酶促处理之前，将纯化获得的蛋白质在 1% SDS ( m/V）存在下，100°C 加热变性处理 5 min。
( 2 ) 用 150 mmol/L 乙酸钠溶液（pH 5.7 ) 将样品稀释 5 倍，加入 10 mU 的 Endo H，将混合液在 37°C 温育 6 h。
( 3 ) 如果酶切后要进行电泳、亲和反应或者免疫检测，那么，要在去糖基化反应后，加入等体积的两倍浓度的电泳样品缓冲液（见 25.3. 2 节 1) ，酶切处理后的样品也可脱盐处理，用于质谱分析。
肽 N-糖苷酶 F去糖基化：
( 1 ) 用 含 0.1% SDS 的 0.1 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 ) 消化处理待酶切的蛋白样品。
( 2 ) 样品在 100℃ 加热 5 min，将蛋白质变性。室温下降温，然后加入含 0.5% Nonidet P-40 的等体积的 0.1 mmol/L Tris- HCl，pH 7.5 ( 见注释 12)。
( 3 ) 用肽 N-糖苷酶 F 37°C 温育样品 24 h ( 1 U 酶/100 μg 蛋白用）。
( 4 ) 酶解消化后，用 4 倍体积的乙醇在 -20°C，过夜沉淀去糖基化蛋白质。
( 5 ) 离心样品。回收沉淀中的去糖基化蛋白，并将其溶解在适当的缓冲液中，供凝胶电泳和质谱分析。
肽 N-糖苷酶 A 去糖基化：
( 1 ) 将 100 μg 蛋白质样品溶解在 500 μl 的 10 mmol/L HCl ( pH 2.2 ) 中，加入 10 μg 胃蛋白酶，37°C 消化 24 h，再次加入同样量的胃蛋白酶，继续消化 24h。100°C 加热 5 min 终止反应。
( 2 ) 冷却样品，然后取 10% 的溶液用 C18 色谱柱纯化肽和糖肽混合物。
( 3 ) 用 5 mL 乙腈冲洗 C18 层析柱，再用 5 mL 水冲洗 C18 层析柱。用蒸馏水将稀释的样品定容至终容积为 1 ml，加样到 C18 层析柱。用 5 mL 水冲洗柱子去除样品中的盐分，用 5 ml 乙腈洗脱结合到柱子上的肽。吹干乙腈浓缩肽样品。用 MALDI-TOF 质谱检测肽和糖肽的分子质量，这样可在内切糖苷酶 A 处理之前，获得糖肽的质量数据。
( 4 ) 将剩余的样品冷冻干燥，溶解在 500 μl 的 100 mmol/L 乙酸钠溶液（pH 5.5 ) 中。
( 5 ) 将样品用 0.1 mU 肽 N-糖苷酶 A 在 37°C 消化 18 h。然后冷冻干燥样 品，用 C18 色谱柱，按照步骤（2 ) 和 步骤（3 ) 的操作，将肽与寡聚糖分开。通过 MALDI-TOF 质谱分析去糖基化肽，比较去糖基化处理前后得到的两种谱型，得到一些由于 N- 糖苷的去除引起的离子质量差异，结合去糖基化过程中所使用的酶和植物糖蛋白的信息，来判断蛋白质上 N-糖苷的种类和结构形式。
这个实验所需要的试剂都包含在检测试剂盒中，商品酶促去糖基化试剂盒由 Prozyme 公司生产。需要说明的是，按厂家说明使用该试剂盒。实验者可以获得有关被测糖蛋白上的糖苷类型（N - 和 O- 连接）的信息。
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