2. 质谱鉴定命令

单个蛋白质点可能被命名为几个名称或代码，如检测点数、匹配数、采集数等。因此，用一个质谱图去关联一个适当的蛋白点没有多大意义。为了避免错误， PROTICdb 的工作流程之一是生成一个携带单一的，送去做质谱鉴定的蛋白点质谱仪 ID 的文件 ( 相当于一个命令)。质谱仪就可以将携带蛋白点 ID 的结果返回到数据库中，这样就避免了名称含混不清的问题。在这个实例中，描述装有切下的蛋白点的微孔板的文件将被提交给数据库。在微孔板图中，每个切下来的蛋白质点都事先被用户命名为“ picked_spot” 。这个工作流程假设这个命令在图像分析数据（蛋白质点检测）被记录到数据库之前被发送到质谱仪。这样，当用户随后提交蛋白点检测和比对数据时，他或她将同时提供与蛋白点检测和比对数据代码相关的适当的“ picked_  spot”命名。这一步至关重要 ，因为它使得数据库将“ picked_ spot” 的编号与比对代码关联起来，确保能准确无误地整合质谱数据。

“ Identification  Order” 创建步骤的输出是一个基本的 “Sequest” 软件兼容的文件。它包括微孔板上的每个样品。这个文件很有用，因为它可用 “sequest” 软件直接读取 ( 见注释 12)。

按以下步骤建立一个新的命令：

( 1 ) 在主菜单选择“ file  based  feeding” — 然后在弹出菜单中选择“ MS   identification  request (in)’’。

( 2 ) 选择 “ order  spot  identifications  from  one  picture/detection”  并提交。

( 3 ) 选择与样品相应的凝胶成像图。（在这个实例中，微孔板上的蛋白点来自同一块凝胶）然后选择 “ DV02041611” 图像。

( 4 ) 点击 “request  MS  identification   order  for   this   picture ” 按钮，一个新表单便出现（图 23- 5 , 第 1 步 ) 。

( 5 ) 点击按钮 “ create   a  new   virtual  detection   for   this   picture ”  创建一个虚拟蛋白点检测结果（记住：前面的图像分析结果直到现在还没有提交），这样就将微孔板中的蛋白点建立在数据库中。当真实的蛋白点检测实验完成后，上传结果，并且将质谱结果填入数据库后，这些蛋白点的信息将被更新。

( 6 ) 选择在第 13 步建立的 “virtual  detections” 加载质谱鉴定结果。当梅拉尼输出文件提交后，那些 “ virtual  detections ” 将被 “real detections ” 所取代。这时名为 “now   you  can  subm it  your  order”   的新表单出现了。（ 图  23.6，步骤  2)。

( 7 ) 输入本次实验所用的微孔板的号码，点击 “set  microplate  number” ，接着点击“ get  the  microplate  template” ，下载 excel 模板文件。在微孔板 excel 模板文件中，输入在这个鉴定命令中所用的微孔板的号码，当前 PROTICdb 用户的邮件地址，以及微孔板中的孔号（12 列 8 行 从 A 到 H) ，所用样品的准确名称：在 23. 3. 3 节 2 中用到的 “ picked _spot” 号码（见注释 1)。保存你的 Excel 文件为 “ tabulation-separated  text” 格式（ 见注释11)。这张图对应着你的质谱仪中微孔板。准备足够多的微孔板文件。在这个演示中只有一个微孔板文件：“ demo,  zip ” 文件夹中的  microplates/microplatedemo.   txt。

( 8 ) 输入上样到微孔板上的样品号码，在这个演示的微孔板上有 9 个样品。

( 9 ) 浏览你的电脑硬盘选择微孔板文件。在这个演示中从准备好的“ demo,   zip” 文件夹中获得 “ microplatedemo.txt ” 文件。注意在微孔板文件中的 e-mail 地址必须与 PROTICdb 中当前用户的 e-mail 地址一致。在 “ related  species” 中输入：根据 NCBI 分类系统的种、属名称（与样品相关的来自其他物种的序列有时用于蛋白质鉴定的检索）。在本演示中输入 “ Oryza  sativa. ”。

( 10 ) 填写余下的表单内容，然后点击 “ Submit” 。如果发生错误，会出现错误提示信息。根据信息提示更改你的文件，重新提交。提交成功会出现 “order  n   created ! ” 信息。记住这个识别命令代码，为方便日后访问鉴定报告。会有一封针对这个命令的输入文件以电子邮件的形式发送到当前用户。保留这个信息，保存这个输入文件。这个文件应当和蛋白点的微孔板一起被送到质谱仪。

3. 蛋白点检测结果文件的上传

使用 Melanie 软件时，你要用相应的 “ picked _ spot ” 名称注释每个蛋白点（见 23.3.3 节而要这样的话，必须建立一个用户定义的 “ picked _ spot ”专栏（见 Melanie 程序说明）。然后导出一份指标文本格式的蛋白点报告。

保存 Melanie 检测文件后，按照如下流程操作：

( 1 ) 在主菜单上选择 “file  based  feeding ”项目，然后在弹出菜单栏中选择“ virtual  spot  detection  (update )   ” 。

( 2 ) 选择与 melanie 结果相应的图像，这里选择 “ DV02041611” 。

( 3 ) 提交。

这时出现一份先前建立的这张凝胶成像的虚拟蛋白点的检测目录（见图 23 -7, 第一步） 。

( 4 ) 选择要更新的虚拟蛋白质检测（本演示中，只有一个虚拟蛋白质检测可以选择)。

( 5 ) 提交。

( 6 ) 出现类似在 23.3.2 节 4 中描述过的  “Spots detection  file upload  form”  表单( 图 23-8, 第二步）。像在 23. 3.2 节 4 中描述过的一样填写这个表单。在 “ demazip ” 文件夹中能找到 Melanie 输出文件 DV02041611.txt 。这张凝胶必须被指定为主凝胶。不填写 “ matchingfile” 栏目。现在还不用 private/public 区域。但是，设立这一项是考虑到未来预期的数据公布政策。

( 7 ) 提交。

数据库处理这个文件的时间较长，这时千万不要中断 PROTICdb。如果发生错误，按照提示更正并重新提交（ 见注释 10)。

当处理完成后，系统将通过 e-mail 将一个成功或错误的通知发送给当前用户，如果发生错误，蛋白点鉴定信息都将不被保存。按照错误报告的建议更正，并重新提交一次文件。

注明蛋白点的位置和丰度数据的凝胶成像现在可以在凝胶浏览器上显示了（见 23.3.5 节 ，凝胶浏览器) 。