3.4 RNA 提取
3.4.1 小麦胚乳总 RNA 提取
提取方法根据 Chang 等 [ 11 ] 改编而来。
( 1 ) 用预冷的研钵和杵（-70°C ) 在液氮里将 2~3 g 组织磨成粉末（见注 8 ) 。
( 2 ) 室温下迅速将磨碎组织转移到有 15 ml 提取缓冲液（加入 300 μl β-巯基乙醇 ) 的离心管中，充分颠倒混匀（ 见注9) 。
( 3 ) 用等体积氯仿：异戊醇（终体积 15 ml ) 抽提两次，液相分离用 15000 g 室温离心 10 min。
( 4 ) 上清液加 0.25 倍体积 10 moI/L LiCl 混匀。4℃ 过夜沉淀 RNA，4℃、15000 g，离心 20 min 获取 RNA。
( 5 ) 500 ml SSTE 悬浮沉淀颗粒。
( 6 ) 用等体积氯仿：异戊醇抽提一次。
( 7 ) 上清液加两倍体积乙醇，-70℃ 沉淀 30 min 以上或者 -20℃ 沉淀 2 h。
( 8 ) 15000 g 离心 20 min 沉淀 RNA。
( 9 ) 75% 乙醇洗涤。
( 10 ) 干燥沉淀并溶解于无核酸降解酶水中。
3.4.2 发芽后 8 天幼苗 RNA 提取
提取方法根据 Cheng 等 [ 12 ] 改编而来。
( 1 ) 用预冷的研钵和杵（-70℃ ) 加液氮里将已知质量组织（大约 1 g 幼叶）磨成粉末（见注9) 。
( 2 ) 将冷冻的粉末快速转移到第二个有 10~15 ml 匀浆缓冲液的研钵中（见注10)，继续研磨至均匀（见注 11)。
( 3 ) 匀浆液转移到 50 ml 带帽的圆底旋盖离心管中，60℃ 孵育 10 min ( 匀浆液终体积 5~10 ml )。
( 4 ) 离心管置冰上冷却，加 0.2 倍体积 pH 5.5 的 5 mol/L 乙酸钾（见注 12) ，轻轻地充分混匀，然后冰上静置 10~15 min。
( 5 ) 10000 g、4℃ 离心 15 min , 取上清液到新的离心管中。
( 6 ) 加等体积酚：氯仿（1 : 1，V/V ) 混匀，拧紧瓶盖并剧烈振荡 10 min。10000 g、21°C 离心 10 min。取上层水相于新离心管中（见注13)。
( 7 ) 水相重复上一步的酚：氯仿萃取和分层。
( 8 ) 往水相加 0~1 倍体积 3 mol/L pH 5.3 乙酸钠和 2.5 倍体积乙醇。混匀后 -20℃ 孵育过夜以提高核酸沉淀效率。
( 9 ) 10000 g 、4℃ 离心 30 min 沉淀核酸，弃上清。倒置离心管数分钟。
( 10 ) 少量无核酸降解酶水（ 300~700 μl ) 溶解沉淀。核酸溶液转移到 Eppendorf 管，加 0.67 倍体积 10 mol/L 氯化锂沉淀 RNA。拌匀，冰上孵育 20~30 min ( 见注14)。
( 11 ) 离心（15000 g，室温，20 min ) 沉淀 RNA，弃上清。
( 12 ) 用尽可能小体积（ 200~300 μl) 的无核酸酶水溶解沉淀，重复氯化锂沉淀，和上一步同样离心沉淀 RNA。
(13 ) 200 μl 无核酸酶水溶解沉淀，加入 15 μl 5 mol/L 乙酸钾（pH 5.5 ) 和 800 μl 乙醇。混匀，离心（15000 g 室温，20 min) 沉淀 RNA ( 见注15)。
( 14 ) 弃上清，加入 1.0 ml 80% ( V/V ) 乙醇，离心洗涤 RNA ( 15000 g，室温，10 min)。
( 15 ) 离心管开盖置于超净工作台，室温干燥沉淀不超过 10 min。溶解于 100~200 μl 无核酸酶水中。将每份样品分成等量小份以避免在反复冻融过程中污染或者降解。
3.4.3 总 RNA 样品除去基因组 DNA
RNA 提取之后用 DNA-free ( DNA 酶处理和清除试剂盒，Ambion) 按照使用说明处理 RNA 片段。该系统专为去除 RNA 样品中的 DNA 杂质和清除处理后的 DNA 降解酶 I，无需加热或苯酚提取。
3.4.4 RNA 定量分析和质量控制
RNA 浓度、完整性及质量检测使用 Nanodrop ND 1000 分光光度计（Labtech Int ,U K ) 和 Agilent 2100 生物分析仪 ( RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies, PaloAlto, CA，USA ) ( 见注 16)。
3.4.5 样品保存
RNA 样品短期（最长 3 个月）保存在 -20℃，长期则在 -80℃。
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