3.5 cDNA 合成

( 1 ) 加 100 μg DNA 酶处理过的总 RNA ( 不超过 20 μl) 、8 μl oligo  (dT)23 锚定引物和无核酸酶水至终体积 28 μl。

( 2 ) 将启动反应混合物在 70℃ 孵育 10 min，置于冰上 5 min。

( 3 ) 向启动反应混合物加入 cDNA 合成反应混合物：10 μl 5x 第一链缓冲液，10 μl 0.1 mol/L DTT，5 μl 50x aa-dNTP 混合物，2 μl Superscript 逆转录酶Ⅲ（ 200 U/L ) ，加无核酸酶水至终体积 50 μl。

( 4 ) 42℃ 孵育 2~3 h。

( 5 ) 用微型离心柱（Qiagen) 参照使用说明纯化 aa-dUTP-dDNA 产物。

( 6 ) 收集最后的洗脱液 10 μl 作为样品。cDNA 的产品将用于准备芯片杂交的探针和实时 RT- PCR 技术。最后反应可不用 50x aa-dNTP 混合物进行（见注 17)。

3.6 cDNA 芯片标记

( 1 ) 为了 cDNA 与突光染料偶联反应，将需要反向染料标记的总 cDNA ( 见第3.5节步骤6 ) 分成两等份（5 μl ) ，并将不同梁料的反应放在单独的管。

( 2 ) 每管加入： 5 μl 氨基烯丙基纯化的 cDNA  ( 见 3 . 5 节步骤 3 ) ，3 μl 1 mol/L NaHCO3 标记缓冲液，2 μl ALexa 荧光染料 555 或者 647，10 ml 无核酸酶水。

( 3 ) 移液器混匀，室温黑暗孵育 1 h。

( 4 ) 用 mini  Elute columns 试剂盒（Qiagen) 去除没有与 aa-dUTP- cDNA 偶联的染料( 见注18)。

3.7  cDNA 芯片杂交

( 1 ) 取 20 μl 混合的标记 cDNA  ( 来自 3. 6 节步骤 6 的两个 Alexa 染料）加入到 25 μl 2x 杂交缓冲液和 2 ml  poly  (dA ) 。

( 2 ) 探针在 95℃ 3 min 变性。

( 3 ) 标记的探针涂在盖片上，并将载片印有 Code  Link 面朝下放置。

( 4 ) 将芯片杂交盒置于烘箱内 42℃ 过夜。

( 5 ) 将芯片置于含有溶液 A 的 Falcon 管（蓝帽）中（见 2. 6 节步骤 2 ) ，室温颠倒 15 min  (见注 19)。

( 6 ) 将芯片转移到第二个含有溶液 A 的 Falcon 管中，室温颠倒 15 min。

( 7 ) 将芯片转移到第三个含有溶液 B 的 Falcon 管中（ 见 2 . 6 节步骤3 ) ，室温颠倒 15  min。

( 8 ) 将芯片转移到第四个含有溶液 C 的 Falcon 管中（见 2 . 6 节步骤3 ) ，室温颠倒 15 min。

( 9 ) 将芯片放置干燥的 Falcon 管中，立刻 8000 g 离心干燥。

( 10 ) 用 Axon 仪器公司的 Gene-Pix 400B 型双激光扫描仪扫描杂交芯片。

3.8 cDNA 芯片数据分析

芯片做图像分析，检测每一个观测点的两种荧光信号的强度，以此来评估成对小麦系之间转录基因的表达差异。数据标准化后，作适合某个模型的统计分析，说明实验设计 ，检测差异表达的显著性。

3.8.1 图像分析和标准化

芯片上的点用 GenePix 软件扫描成图像（Gene  Pix 第 5 版，美国 Axon 仪器公司），然后所有的点进行人工检测，排除杂交失败或者信号弱的。图像分析给出了每一点的所有像素，这些数据包含了两种荧光染料信号（647和 555 ) 的平均值和 Log2 比率值。这些数据专用于差异表达分析。将数据从 GenePix 导入 GeneSpring 软件包 （GeneSpring 6. 2 美国硅遗传公司），然后信号强度的 Log2 比率值进行标准化。本研究中，一个点的 Log2 比率值（差异表达的）（ M ) 和 Log2 乘积（亮度的）（ A ) 之间的比较表明，局部加权光滑描点技术（ LOWESS ) 标准化处理，可用于消除数据不佳的趋势。换句话说,所有点的 Log2 比率值乘以 （ across ) 光 强 （ Log 乘积）应该在一个恒定范围内，但图像显示有一些会随着 A 増加而发生变化的趋势。因此，标准化处理的目的是消除 Log2 比率数据的系统变异（ 比如由于实验过程）。局部加权光滑描点技术（ LOWESS ) 标准化处理，是通过逐点检测 M 和 A 值之间的关系，然后相应地调整 M 值（adjusted  M = MLOWESS- fittedM) 。由于有两个独立的实验， L 88-31、 L 88-18和 B 102-1-1的数据与 Cadenza的数据分开处理。

3.8.2 统计分析

参考 Kerr  [ 15 ] 讨论的方法，使用 GenStat 统计系统（ GenStat 第 7 版 ，GenStatProcedure  Library   Release  PL15，  Lawes  Agricultural   Trust,  Rothamsted  Research  Harpenden,  U K ) 分析规范化的数据（ 进一步的详细信息见[ 5 ] 及其补充材料）。在估计基因的固定效应之前，用符合 Log2 比率的线性混合模型来估算实验设计（ 生物学和技术重复）的随机效应。该模型通过模型计算用数据的整体残差（ 噪声）估计标准误参 数（一个基因一个参数）。每个参数对其标准误的比率服从残留自由度的 t 统计分布，这使得从 0 (Log2 范围）开始的差异表达统计上显著性得到评估。在我们的研究中，通过表达量和拷贝数筛选显著差异表达基因（ P <0.05 )，只有那些表达差异大于 1.5 倍并且存在多 2 次以上重复的基因被保留下来做进一步分析。

3.8.3 用实时 RT-qPCR 验证差异表达

挑选转录本做实时 RT- qPCR 验证芯片表达数据，见 3.13 节。