实质等同性（蛋白质组学）实验（一）

实验材料 ESI-MSMALDI - MS

试剂、试剂盒 提取缓冲液

仪器、耗材 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验步骤

众所周知，在实验室内和实验室间难以保证双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的重复性。在我们实验室，强制性地要求严格遵守标准操作程序（sop ) , 以确保不同的操作者可以获得可重复的分离结果。小麦白面粉样品的 2D 胶图谱示例如图 16.1 所示。采用 Tris-CaCl2 提取法提取的并非“总蛋白”，而是小麦面粉中除谷蛋白之外的有代表性的蛋白样品。如果提取总蛋白，由于谷蛋白的含量很高，可能会掩盖掉其他较低丰度的蛋白质。同样的问题也可能发生在其他含有高丰度蛋白的组织中，尤其是绿色组织中存在的二磷酸核酮糖竣化酶（Rubisco) 。

我们提供了三种方法。第一种是以使用 Tris-CaCl2 提取为特征的提取法，在我们实验室被用于转基因（GM ) 与非转基因（non- GM ) 小麦的实质等同性的大规模蛋白质组学研究。第二种和第三种提取方法被广泛用于文献中，可适用于各种不同组织。

3.1 蛋白质提取

3.1.1 利用 Tris-CaCl2 缓冲液提取白面粉蛋白（参照 [ 11 ])

( 1 ) 2 g 白面粉加入 5 ml 预冷（4℃ ) 提取液，4℃ 搅拌 30 min。

( 2 ) 4℃，10000 g 离心 30 min，除去不溶物。

( 3 ) 保留上清于液氮中迅速冷冻，小份分装，储存于 -80℃，待用。

( 4 ) 用 Bradford 法测定蛋白质含量，以 BSA 作标准品。

3.1.2 酸 / 丙酮沉淀法提取白面粉或绿色组织蛋白（参照 [ 4 ] )

3.1.3 面粉

( 1 ) 在 50 ml Falcon 离心管中，悬浮 5 g 面粉于 20 ml 溶液 I 中，以最大速度涡旋 2 min，-20℃ 静置 1 h。

( 2 ) 4℃，15000  g 离心 10 min。

( 3 ) 弃上清，加 5 ml 溶液II 涡旋以重悬沉淀。

( 4 ) 4℃，15000 g 离心 10 min。

( 5 ) 重复步骤 3、4 两次。

( 6 ) 弃上清，在通风橱中，连续氮气流下干燥沉淀（确保无样品损失）。

( 7 ) 用 1 ml pH 适宜的复水缓冲液重悬 40 mg 干燥样品，涡旋 5 min，室温 13000 g 离心 10 min。

( 8 ) 保留上清，小份分装。在液氮中迅速冷冻。

( 9 ) 储存于 -80℃。

( 10 ) 用前测定小份样品的蛋白质浓度。

3.1.4 绿色组织

( 1 ) 使用预冷的研钵和研棒，液氮中研磨速冻的叶片。

( 2 ) 用 20 ml 溶液 I 悬浮 2 g 叶片粉末，以最大速度涡旋 2 min，-20℃ 沉淀 1 h。

( 3 ) 4℃，15000 g 离心 10 min，弃上清。

( 4 ) 加 5 ml 溶液II，涡旋重悬沉淀，4℃，15000 g 离心 10 min。

( 5 ) 重复步骤 4 两次，在通风橱中，连续氮气流下干燥沉淀，确保无样品损失。

( 6 ) 用 1 ml pH 适宜的复水缓冲液重悬 20 mg 干燥样品。

( 7 ) 涡旋 5 min , 室温 13000 g 离心 5 min。

( 8 ) 保留上清，小份分装。液氮中迅速冷冻，储存于 - 80℃ 备用。

( 9 ) 用前测定小份样品的蛋白质浓度。

如提取的蛋白中有叶绿素污染，可尝试 PEG/MgCl2 沉淀法（见注 3 ) 。

3.1.5 奥斯本分级分离法（ 参照 [ 12 ] )

( 1 ) 100  mg 面粉加 1 ml 水饱和正丁醇，室温下搅拌 1 h。

( 2 ) 室温下 5000 g 离心 10 min , 去上清。这是一个可选的步骤，用于“ 除脂”。

( 3 ) 抽提 “白蛋白/球蛋白” ：沉淀（来自步骤2 ) 加 1 ml 0.5 mol/L NaCl，室温下搅拌 1 h。如上述步骤离心，保留上清并重复抽提。

( 4 ) 合并上清，采用 5%（V/V）乙酸在 4℃ 充分透析 48 h，期间至少更换 4 次透析液，每次 5 L。

( 5 ) 抽提 “醇溶蛋白”：沉淀（来自步骤3 ) 加 1 ml 70%（V/V）乙醇室温搅拌 1 h。如前所述离心。保留上清并重复抽提。

( 6 ) 合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更换 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。

( 7 ) 抽提 “谷蛋白”：沉淀（来自步骤 5) 加 1 ml 50%（V/V）丙醇/2%（V/V）β-巯基乙醇/1%（V/V）乙酸，室温搅拌 1 h ( 注意：如有需要，可直接用 DTT 代替 β-巯基乙醇）。如前所述离心，保留上清并重复抽提。合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更换 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。

( 8 ) 透析后，冻干所有溶液。

( 9 ) 最终的沉淀（来自步骤 7 ) 可用 1 ml “总蛋白提取缓冲液” （IEF 复水液）提取：室温下混合抽提 1 h。如前所述离心，保留上清。分成小份，液氮中迅速冷冻，储存于 -80°C 。