通用型植物线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书（中文版）

　　主要用途

　　通用型植物线粒体DNA萃取试剂是一种旨在通过物理或化学破膜及离心处理方法，从植物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体细胞器，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜植物组织，包括叶片（leaf）、谷粒（grain）、种子（seed）、以及培养细胞的线粒体核酸成分的分离。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。

　　技术背景

　　线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的最重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、能量代谢等研究的主要对象。线粒体DNA的分离和定量以及突变分析是研究中必不可少的。

　　产品内容

　　清理液（Reagent A） 200毫升

　　裂解液（Reagent B） 80毫升

　　净化液（Reagent C） 20毫升

　　强化液（Reagent D） 10毫升

　　保存液（Reagent E） 100毫升

　　破膜液（Reagent F） 6毫升

　　去干扰液（Reagent G） 600微升

　　酶解液（Reagent H） 600微升

　　萃取液（Reagent I） 6毫升

　　浓缩液（Reagent J） 2毫升

　　助沉液（Reagent K） 20微升

　　沉淀液（Reagent L） 20毫升

　　纯化液（Reagent M） 20毫升

　　缓冲液（Reagent N） 1毫升

　　产品说明书 1份

　　保存方式

　　保存净化液（Reagent C）、去干扰液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

　　用户自备

　　15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放

　　50毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗

　　1.5毫升离心管：用于保存线粒体

　　4℃台式离心机：用于沉淀细胞

　　4℃超速离心机：用于分离细胞器成分

　　微型台式离心机：用于沉淀核酸

　　尼龙丝或60微米尼龙网：用于去除植物裂解残渣

　　小型漏斗：用于过滤的装置

　　DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

　　58℃恒温水槽：用于孵育反应物

　　涡旋震荡仪：用于混匀

　　实验步骤

　　植物组织线粒体DNA分离（物理法）

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。

　　准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量

　　（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管

　　（选择步骤）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次

　　即刻用刀片切碎组织

　　放进一个预冷的15毫升锥形离心管

　　加入预冷的5毫升裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项7）

　　（选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上

　　（选择步骤）将所有组织匀浆液移入到小型漏斗里过滤（注意：可以使用4层纱布替代）

　　将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管，放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣

　　放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）

　　加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　涡旋震荡15秒，混匀颗粒群

　　转入1.5毫升离心管

　　置入冰槽中孵育15分钟

　　加入30微升去干扰液（Reagent G）

　　用200微升枪头上下抽吸混匀

　　放进37℃恒温水槽孵育15分钟

　　加入30微升酶解液（Reagent H）

　　涡旋震荡15秒

　　放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时

　　置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）

　　加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）

　　涡旋震荡5秒

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）

　　加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管

　　加入1微升助沉液（Reagent K）

　　加入800微升沉淀液（Reagent L）

　　在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀

　　放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）

　　小心抽掉上清液

　　加入1毫升纯化液（Reagent M）

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心抽掉上清液

　　空气中晾干沉淀颗粒群

　　加入20微升缓冲液（Reagent N）

　　溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应

　　植物组织线粒体DNA分离（化学法）

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。

　　准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量

　　（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管

　　（选择步骤）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次

　　移入一个液氮冻存管

　　即刻放入液氮罐过夜

　　次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）

　　放进一个15毫升锥形离心管

　　加入预冷的5毫升裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

　　加入预冷的500微升强化液（Reagent D）

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）

　　加入预冷的5毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀

　　（选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上

　　（选择步骤）将所有组织匀浆液移入到小型漏斗里过滤（注意：可以使用4层纱布替代）

　　放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣

　　放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）

　　加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　涡旋震荡15秒，混匀颗粒群

　　转入1.5毫升离心管

　　置入冰槽中孵育15分钟

　　加入30微升去干扰液（Reagent G）

　　用200微升枪头上下抽吸混匀

　　放进37℃恒温水槽孵育15分钟

　　加入30微升酶解液（Reagent H）

　　涡旋震荡15秒

　　放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时

　　置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）

　　加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）

　　涡旋震荡5秒

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）

　　加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管

　　加入1微升助沉液（Reagent K）

　　加入800微升沉淀液（Reagent L）

　　在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀

　　放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）

　　小心抽掉上清液

　　加入1毫升纯化液（Reagent M）

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心抽掉上清液

　　空气中晾干沉淀颗粒群

　　加入20微升缓冲液（Reagent N）

　　溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应

　　植物细胞或原生质体线粒体DNA分离（物理法）

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。

　　准备5 X 107植物细胞或原生质体

　　移入一个50毫升锥形离心管

　　放入台式离心机离心10分钟，速度为200g

　　小心抽去上清液

　　加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞

　　放入台式离心机离心10分钟，速度为300g

　　小心抽去上清液

　　加入预冷的5毫升裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

　　即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项7）

　　将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管，放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣

　　放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）

　　加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　涡旋震荡15秒，混匀颗粒群

　　转入1.5毫升离心管

　　置入冰槽中孵育15分钟

　　加入30微升去干扰液（Reagent G）

　　用200微升枪头上下抽吸混匀

　　放进37℃恒温水槽孵育15分钟

　　加入30微升酶解液（Reagent H）

　　涡旋震荡15秒

　　放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时

　　置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）

　　加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）

　　涡旋震荡5秒

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）

　　加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管

　　加入1微升助沉液（Reagent K）

　　加入800微升沉淀液（Reagent L）

　　在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀

　　放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）

　　小心抽掉上清液

　　加入1毫升纯化液（Reagent M）

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心抽掉上清液

　　空气中晾干沉淀颗粒群

　　加入20微升缓冲液（Reagent N）

　　溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应

　　植物细胞或原生质体线粒体DNA分离（化学法）

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。

　　准备5 X 107植物细胞或原生质体

　　移入一个50毫升锥形离心管

　　放入台式离心机离心10分钟，速度为200g

　　小心抽去上清液

　　加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞

　　放入台式离心机离心10分钟，速度为300g

　　小心抽去上清液

　　加入预冷的5毫升裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　（选择步骤）超声波处理1分钟

　　在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

　　加入预冷的500微升强化液（Reagent D）

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）

　　加入预冷的5毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀

　　放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣

　　放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）

　　加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　涡旋震荡15秒，混匀颗粒群

　　转入1.5毫升离心管

　　置入冰槽中孵育15分钟

　　加入30微升去干扰液（Reagent G）

　　用200微升枪头上下抽吸混匀

　　放进37℃恒温水槽孵育15分钟

　　加入30微升酶解液（Reagent H）

　　涡旋震荡15秒

　　放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时

　　置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）

　　加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）

　　涡旋震荡5秒

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）

　　加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管

　　加入1微升助沉液（Reagent K）

　　加入800微升沉淀液（Reagent L）

　　在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀

　　放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）

　　小心抽掉上清液

　　加入1毫升纯化液（Reagent M）

　　放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心抽掉上清液

　　空气中晾干沉淀颗粒群

　　加入20微升缓冲液（Reagent N）

　　溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应

　　注意事项

　　本产品为20次操作（1克植物组织或5 X 107细胞）

　　线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行

　　操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）

　　建议使用足够的组织或细胞量

　　建议植物组织使用组织匀浆器操作；德国的BRAUN细胞匀浆器最为理想

　　建议严格控制操作时间

　　通常匀化次数为80下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数。

　　通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

　　裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚类物质的作用

　　不同组织，其线粒体含量不同；通常1克植物组织的线粒体含量为10至50微克线粒体蛋白

　　试剂中的溶液使用前摇匀；酶解液（Reagent H）需放进37℃冻温育许；为避免反复冻融，建议适量分装

　　通常1克植物组织或5 X 107细胞中提取的线粒体DNA达1至10微克

　　13． 本产品所获得的线粒体DNA纯度和产量最为理想，确保无核DNA和外源性DNA污染

　　本公司提供系列植物线粒体分析技术产品

　　质量标准

　　本产品经鉴定性能稳定

　　本产品经鉴定无核酶污染

　　本产品经鉴定萃取产量和纯化程度高

　　本产品经鉴定无基因组DNA污染

　　来源：上海一基实业有限公司

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