一、样品制备试剂的准备
二、细菌细胞样品的裂解处理步骤
三、人培养细胞样品的裂解处理步骤
四、膜蛋白裂解方法步骤
一、样品制备试剂的准备
1、裂解缓冲液储备液的准备
下述本样品制备方法已经过优化, 并被证明配合使用PF-2D 试剂盒可获得最佳的结果。您若选择其他的样品处理和细胞裂解方法，请务必避免使用离子型的表面活性剂、磺酸盐或者其它钠盐成份。建议也不能使用Triton X-100。
1）裂解缓冲液储备液中试剂组份的浓度：
尿素 (urea) (Sigma P/N: U0631) 7.5M
硫脲 （thiourea）(Sigma P/N:T7875) 2.5M
甘油（glycerol）(Sigma P/N:G6279) 12.5%
Tris(Fisher, p/n: BP154-1,分子生物级) 50mM
n-辛基葡糖苷 (n-octylgucoside)（Sigma P/N: O8001） 2.5%(用量很大)
TCEP (Tris-(carboxyethyl)phosphine hydrochloride)
(Sigma P/N: C4706) 6.25 mM
蛋白酶抑制剂 (Protease inhibitor cocktail in water for general use to inhibit
the activity of serine, cycteine,aspartic, and metalloproteases)
(Sigma P/N:P2714) 1.25mM
2)12.5%甘油溶液（50mL）的配制
·量取6.25mL甘油到50mL的量筒；
·加蒸馏水至指定刻度（50mL）。
3）31.45mM蛋白酶抑制剂溶液（10mL）的配置
·在P/N P2714蛋白酶抑制剂中加入10.0 mL的水，混匀。
·分装到2mL的小瓶中，放置在-20℃保存备用。
4）裂解缓冲液储备液（50mL）的配制
A、称取以下个化合物组份放置在100mL的烧杯中
尿素22.52克
硫脲9.52克
Tris0.304克
n-辛基葡糖苷 1.25克
TCEP0.0896克
B、量取12.5% 的甘油溶液20mL和取31.45mM蛋白酶抑制剂溶液2.0mL, 加到上述烧杯中，充分搅拌，至完全溶解。
·把溶液转移到50mL的量筒（量杯中）。
·添加12.5%的甘油溶液，至50mL。
·分装以上的缓冲溶液储备液到小瓶中，每瓶2.0mL,-20℃条件保存备用。
二、细菌细胞样品的裂解处理步骤
1、细胞的破碎：
1）将沉淀的细菌细胞悬浮在0.4mL的50mM Tris（用10%的HCl调节pH值到7.8-8.2）中, 剧烈振荡（Votex
rigorously）充分混合，然后在冰浴中用超声波破碎仪（微型超声探头）破碎处理，重复两次，每次30秒。此过程用于破碎细胞膜。后加入1.6mL的裂解缓冲液储备液，充分混合。若沉淀的细菌细胞量较大（总体积超过0.1mL）不易于悬浮在0.4mL的50mM
Tris溶液中, 则将0.4mL的50mM Tris溶液(用10%的HCl调节pH值到7.8-8.2)与1.6mL的裂解缓冲液储备液预混合,
后用于悬浮细菌细胞沉淀物。剧烈振荡后，与上述同样超声破碎处理。
上述所获最后细胞裂解液的组份是：6M的尿素、2M的硫脲、10%的甘油、50mM 的Tris、2%的n-辛基葡糖苷、5 mM TCEP和1mM蛋白酶抑制剂。
2） 在4℃条件下以20000g的离心力冷冻离心60分钟 （离心力务必达到或大于20000g）。
3）移取上清溶液。若上清样品不立即使用，请储存于-80℃（最佳条件）或-20℃的无霜冰箱中。
2、用初始缓冲液（Start buffer）交换处理细胞裂解液
1）在上述细胞裂解液中，加入初始缓冲液至最后体积为2.5mL，充分混合。
2）用约25mL初始缓冲液平衡PD-10柱（编号：17-0851-01）。
3）加入第1）步骤获得的2.5mL样品到PD-10柱, 丢弃洗脱液。
4）用初始缓冲液洗脱, 从PD-10柱中洗脱蛋白质, 收集前3.5mL部分。
5）所获得的3.5mL样品即可用于HPCF 1D柱的进样分离分析。
* 为检验所获得样品的优劣，可取50uL上述已经交换过的样品进样到HPRP
2D柱，观察所有蛋白的反相分离图谱。在这一步,如果样品制备有一些问题,在分析该色谱图后将会鉴别出来。注意:根据化合物和蛋白的量预测样品,
在这时应该得到一张“豪猪”状的色谱图(a very "spikey or porcupine" liking
chromatogram)，使你分析的样品有意义,如果没有这样的蛋白图谱, 请停止进行色谱聚焦分离分析步骤，继续摸索样品制备的过程和步骤。
三、人培养细胞样品的裂解处理步骤
1、细胞的破碎：
1）将0.4mL的细胞系样品与1.6mL裂解缓冲液储备液充分混合好。若细胞是沉淀物， 则先悬浮于0.4mL的50mM Tris（用10%的HCl调节pH值到7.8 - 8.2）中，充分振荡混合, 再加入1.6mL裂解缓冲液储备液，充分振荡混合。
若沉淀的细胞量较大（总体积超过0.1mL）不易于悬浮在0.4mL的50mM Tris溶液中，则将0.4mL的50mM Tris溶液(用10%的HCl调节pH值到7.8-8.2)与1.6mL的裂解缓冲液预混合, 后用于悬浮细胞沉淀物。剧烈振荡混合。
上述所获最后细胞裂解液的组份是：6M的尿素、2M的硫脲、10%的甘油、50mM 的Tris、2%的n-辛基葡糖苷、5 mM TCEP和1mM蛋白酶抑制剂。
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