2）在4℃条件下以20000g的离心力冷冻离心60分钟 （离心力务必达到或大于20000g）。
3）移取上清溶液。若上清样品不立即使用，则须储存于-80℃（最佳条件）或-20℃的无霜冰箱中以防止蛋白质的降解。
2、用初始缓冲液（Start buffer）交换处理细胞裂解液
1）在上述细胞裂解液中，加入初始缓冲液至最后体积为2.5mL，充分混合。
2）用约25mL初始缓冲液平衡PD-10柱（编号：17-0851-01）。
3）加入步骤第1）所获得的2.5mL样品到PD-10柱, 丢弃洗脱液。
4）用初始缓冲液洗脱, 从PD-10柱中洗脱蛋白质,收集前3.5mL部分。
5）所获得的3.5mL样品即可用于HPCF 1D柱的进样分离分析。
* 为检验所获得样品的优劣，可取50uL上述已经交换过的样品进样到HPRP
2D柱，观察所有蛋白的反相洗脱色图谱。在这一步,如果样品制备有一些问题, 在分析色谱图后将会鉴别出来。注意: 根据化合物和蛋白的量预测样品,
在这时应该得到一张“豪猪”状的色谱图(a very "spikey or porcupine" liking
chromatogram)，使你分析的样品有意义,如果没有这样的蛋白图谱, 请停止进行色谱聚焦分离分析，继续摸索样品的制备方法。
四、膜蛋白裂解方法步骤
1、膜蛋白裂解缓冲液的组份及其终浓度
尿素5M
硫脲2M
甘油10%
Tris-HCl50mM (pH 7.8-8.2, 10-25℃)
n-辛基葡糖苷2.0%
SB3-10(N-decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate) 2.5%(w/v)
TCEP (Tris (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) 5 mM
蛋白酶抑制剂 1.0mM
2、10%甘油溶液（100mL）的配制
1）量取1mL甘油到100mL的量筒；
2）加蒸馏水至指定刻度（100mL）。
3、31.45mM蛋白酶抑制剂溶液（母液）（10mL）的配置
1） 在P/N P2714蛋白酶抑制剂中加入10.0 mL的水，混匀。
2） 分装到2mL的小瓶中，放置在-20℃保存备用。
4、裂解缓冲液储备液（50mL）的配制
1）取10% 的甘油溶液20 mL 放在100 mL的烧杯中；
2）加入Tris0.304 g (Fisher, Part Number: BP154-1),搅拌至完全溶解（50Mm）;
3）慢慢加入硫脲7.61 g (Sigma, Part Number: T7875, FW 76.12), 搅拌至完全溶解;
4）慢慢加入15.02 g尿素(Sigma, Part Number: U0631, FW 60.06) , 搅拌至完全溶解;
5）慢慢加入1.0 g n-辛基葡糖苷(Sigma, Part Number: O8001, FW 292.4), 搅拌至完全溶解;
6）慢慢加入1.25 g SB3-10 (Sigma Part number: D4266, FW 307.5) , 搅拌至完全溶解;
7）慢慢加入0.072 g TCEP (Sigma, Part Number: C4706, FW 286.7), 搅拌至完全溶解;
8）加入31.45mM蛋白酶抑制剂溶液1.6mL, 搅拌至完全溶解;
9）转移到50mL的量杯中, 加10%甘油溶液至50mL容量;
10）分装到2.0 mL的小瓶中, 在-20℃中保存备用。
5、膜蛋白裂解方法步骤
1）取以上的裂解缓冲液2.0 mL悬浮细胞膜样品, 充分振荡混合。
2）在4条件下离心力20000g下冷冻离心60分钟（离心力务必大于或
等于20000g）。
3）移取上清液。若上清液样品不立即使用，则须储存于-80℃（最佳条件）或-20℃的无霜冰箱中以防止蛋白质的降解。
6、用初始缓冲液（Start buffer）交换处理细胞裂解液
1）在上述细胞裂解液中，加入初始缓冲液至最后体积为2.5mL，充分混合。
2）用约25mL初始缓冲液平衡PD-10柱（编号：17-0851-01）。
3）加入步骤第1）所获得的2.5mL样品到PD-10柱, 丢弃洗脱液。
4）用初始缓冲液洗脱, 从PD-10柱中洗脱蛋白质,收集前3.5mL部分。
5）所获得的3.5mL样品即可用于HPCF 1D柱的进样分离分析阶段。
*为检验所获得样品的优劣，可取50uL上述已经交换过的样品进样到HPRP 2D柱，观察所有蛋白的反相分离图谱。在这一步,如果样品制备有一些问题, 在分析谱图后将会鉴别出来。注意:根据化合物和蛋白的量预测样品,在这时应该得到一张“豪猪”状的色谱图(a very "spikey or porcupine" liking chromatogram)，使你分析的样品有意义, 如果没有得到这样的蛋白图谱,请停止进行色谱聚焦分离分析, 继续摸索样品制备步骤和方法。
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