成功的RT PCR的要素
1、高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到
cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）选择性分离poly（A）+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly（A）+
RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly（A）+
RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。但是我个人认为不会，除非mRNA抽提试剂盒或者相关方法对内参以及目的基因的mRNA有选择性，否则样本间抽提效率的差别完全可以用内参来校正。然而，当分析稀有mRNA时，poly（A）+
RNA会增加检测的灵敏度。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10，000×g离心5分钟。也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保护试剂。
Merck的inhibitor是世界第一，大家可以选择性使用。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的
RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase
A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
2、使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-mlV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。而且降低逆转录酶的RNaseH活性会加大RT酶的热稳定性。通常有点突变和缺失突变两种，优先选择缺失突变的。此外
AMV酶热稳定性更高，推荐。
3、提高逆转录保温温度较高的温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物（三种引物都可以的）在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤之后反应条件如何设置我没有经验，是加入酶和其他反应组分后变性再RT还是直接开始RT程序？我认为后者才对。此外是否可以考虑加入RNA
inhibitor更为安全一些。还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。上面简单的处理方法倒是不花钱，呵呵。对这些困难模板的扩增可以使用一些特殊的逆转录酶，逆转录反应可以置于较高温度下进行，增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。此外注意不要在高于60℃时使用oligo（dT）和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。此外RNA在高于65℃时开始水解，对于
≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。
4、使用逆转录反应的增强剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入
20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MmlV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为
0.4%，这不足以抑制PCR。5、RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous
scherosisⅡRNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。通常是不推荐此方法的。
三种RT引物的选择
Oligo dT 要求RNA必须有Poly
A，所以真核生物的mRNA适用。他主要适合长链甚至全长mRNA的RT，这样对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染，RNA降解和
RNA断裂（如电泳中出现多条非典型的带而又明确不是DNA带那么就要考虑RNA出现断裂的情况）其RT通常有标准浓度，比较好掌握。随机引物适合各种
RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低），关于是否对具有复杂二级结构的模板有特殊的优点只能说maybe，事实上很多情况下我们是没有分析RNA的二级结构的。（我用RNAstructure分析，但是一般分析发现复杂二级结构不是想到换用随机引物，而是考虑做巢式
PCR或者考虑做二步PCR，因为引物设计处有连续复杂的二级结构设计引物就会设计不出来，但是如果引物退火处后面不远就出现连续复杂的二级结构那么不用二级结构分析软件是不容易发现的而且它也会严重影响PCR扩增）事实上引物退火后面不远处如何出现严重连续二级结构是我们需要注意的，改用随机引物做RT
倒是是比较好的选择，但是如果不在PCR阶段针对性的修改策略是不行的。特异性引物注意只能用你设计引物时的下游引物做RT，自己画图就明白了。适合各种
RNA的RT，适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，这样对操作者的技战术水平提出了严峻挑战。所以通常适用于引物设计和合成有保障，引物退火处之后没有复杂二级结构，目的模板丰度高（注意丰度高是指的目的gene的mRNA丰度高，与总RAN是两个概念）的情况。通常不推荐。有些试剂核诸如Qiagen的RT试剂盒很讨厌不带随机引物和Oligo
dT，这时可以先用特异性引物试一试，看看情况再说，做不出来也不要紧，这不是RT的最佳选择，只是不用多花钱的妥协选择而已^_^。至于其合成的
cDNA更为特异从而以后PCR更为特异的说法虽然有一定的道理，但是纯属于理论性质的，不能作为选择他的原因。通常加入某个引物（模板其实没有这个序列）RT，然后用这个引物扩增还是可以得到很多非特异扩增产物的，只是片断一般不超过400bp。所以使用特异性引物特异性更高的说法不能全信，尤其是扩增片断比较短的时候（小于400bp）。因为很少有RT酶可以在退火温度反应而不失活的。除非少数耐热的很贵的RT酶。
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