文章导读
m6A是mRNA中普遍存在的一种内部修饰，通过多种机制，比如调控mRNA的剪接、表达、降解、翻译等对mRNA的命运产生不同影响。为了探究m6A修饰在不同组织之间、不同发育阶段的差异，m6A位点在转录本上的位置分布，以及这些分布差异可能对基因调控的进化产生怎样的影响，近期Nucleic Acid Research (IF=11.147)杂志上发表了一篇文章Dynamic landscape and evolution of m6A methylation in human, 通过对9种人类组织的m6A测序，分析了m6A甲基化位点在不同组织中的分布特点、潜在调控机制和进化。
发表期刊：Nucleic Acids Research
影响因子：11.147
发表时间： 2020.5.14
实验方法: m6A-seq, RNA-seq
文章链接：Dynamic landscape and evolution of m 6 A methylation in human
研究内容
1.成年人组织中m6A表达谱
首先，为了探索m6A在成年人组织中的表达谱，作者对成年人的小脑、额皮质、心脏、肾、肝、肺、肌肉、脾、和睾丸9种组织，每种3重复样，进行了m6A-seq（云序提供此服务），共检测到101340个甲基化位点，其中超过36%的m6A位点仅在1种组织中发现，而全部组织中 共有的m6A位点仅占5.5%，揭示了m6A甲基化的高度组织特异性。生信分析显示m6A峰中的保守序列为RRACH, 多种组织中 共有的m6A位点多集中于终止子附近，而组织特异性的m6A位点则不突出集中于此，结合GO分析，作者指出，终止子附近的m6A位点主要调控的是维持基本细胞功能的基因，如染色质排列、细胞分解代谢过程与组蛋白修饰相关基因，而m6A位点在其他区域的基因可能更多的是组织特异性功能的基因。
2.m6A甲基化富集在非典型的剪切位点
mRNA的成熟过程涉及到内切酶剪切和聚腺苷酸化，剪切位点位于多腺苷酸化信号（PAS）下游。多数真核生物的基因具有多个PAS，而可变聚腺苷酸化（APA）会导致基因异构型（isoform）的表达。为了探究m6A对APA的影响，作者首先分析了剪切位点前后40bp范围内的m6A位点，发现他们绝大部分都正好位于剪接位点处，保守序列为AAACH。于是作者针对剪切位点区域序列，通过在敲除甲基化酶METTL3的HEK293T细胞中的双荧光素酶实验（云序提供此服务）验证了剪切位点处的m6A修饰会抑 制聚腺苷酸化过程。接着，根据序列将APA位点分为典型和非典型两类，分析发现大部分m6A是发生在非典型的APA位点。这些结果表明，m6A可能通过调控APA过程影响生成的mRNA。
3.m6A修饰在发育过程中动态变化
为了探究m6A修饰在发育中的动态变化，作者选用了已发表文献中来自胎儿的7种组织的m6A-seq数据，与本次成年人组织的测序数据采用同样方式分析。胎儿组织中，尽管m6A位点同样富集在终止子区，但CDS区域的m6A位点比例明显高于成年人组织。
4.组织之间和发育阶段之间m6A保守序列的调控
为了探究m6A保守序列在不同组织之间和发育阶段之间的差异，RRACH保守序列被细分为4种子序列。对比胎儿和成年人的组织，发现心脏、肾和肺组织中m6A保守序列比例发生变化，而肝和肌肉在成年前后m6A保守序列比例相对不变。对比不同组织中的保守序列发现，AAACH和GGACH两种保守序列的比例在组织间差异较大，且同时含有这两种序列的m6A峰的数目明显低于随机重排后分析出的预测数目，暗示了这两种保守序列可能是由不同的甲基化酶亚基互作用蛋白来识别的。
5.进化角度分析人类m6A修饰位点
作者通过比较人鼠之间保守m6A位点比例和保守对照A比例，来评估CDS区域m6A位点面临的自然选择压力，发现发生于第 一个密码子处的m6A的周围序列保守程度低，可能由于此处的m6A会带来不利的影响比如影响tRNA结合，而发生于第三个密码子处的m6A则受到进化选择的影响，暗示此处的m6A可能带来某些功能变化。对于3’UTR区m6A的分析发现此区域m6A整体受到负向自然选择。另外，作者还发现，甲基化程度高的位点正受到更强的选择压力，暗示这些m6A保守序列可能更容易被甲基化酶结合，并同时带来功能变化。
6.人类群体基因组分析m6A位点的正向自然选择
为了探究m6A位点是否是近代从正向自然选择中获得的，作者联合单核苷酸突变（SNP）分析和 RNA-seq（云序提供此服务）数据的分析，发现RRAC保守序列中的SNP会影响m6A甲基化，其中一些SNP突变后形成的m6A保守序列受到正向自然选择。从这些突变后会形成m6A保守序列的SNP中筛选出102个在人类不同群体中存在差异的SNP, 进一步分析发现21个位于非编码RNA上，表明他们的群体差异很大可能是由于m6A修饰被正向自然选择而导致的。另外，这102个m6A SNP位点中大部分与疾病和表型相关，比如与胆固醇水平、体质指数以及动 脉粥样硬化相关。
总结
本文通过m6A-seq, RNA-seq, 双荧光素酶实验等手段，研究了7种人类组织中的m6A位点，结合数据库信息和生信分析，揭示了组织特异性甲基化位点的广 泛存在，发现了m6A可能影响mRNA成熟过程中的选择性聚腺苷酸环化。通过比较胎儿和成人的m6A位点发现m6A在胎儿组织中多发生在CDS区域，并且甲基化保守序列在不同组织中变化。此外，从进化角度，不同基因上的m6A位点受到的选择压力不同，在人类群体中获得的m6A位点明显处于正选择之下，并且与性状或疾病相关。本文为后续研究m6A在不同组织中的功能提供了基础信息，并揭示了m6A对人类环境适应和疾病敏感性的作用。
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