【实验原理】
Trizol 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA 的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀获得。
【实验仪器】
1. 匀浆机
2. 低温离心机
3. 涡旋器
【试剂及配制】
1. Trizol
2. 三氯甲烷
3. 异丙醇
4. DEPC
5. DEPC 处理水
DEPC 溶解于ddH2O 中使其终浓度位0.1%，37℃处理12 h 或室温过夜，15 磅湿热消毒15 min。
6. 75%乙醇（0.1% DEPC 水配制）
【实验步骤】
1. 标本处理
1） 组织：50-200 mg 组织/ml Trizol，匀浆，室温放置5 min；
2） 细胞：1 瓶细胞（25cm2）/ml Trizol，缓慢摇动，室温放置5 min，反复吹吸几次收集，此时可保存于-70℃。
2. 去蛋白，去DNA
1） 加入0.2 ml 三氯甲烷，用力振摇15 sec；
2） 室温放置2-3 min；
3） 4℃，12,000 rpm 离心15 min；
4） 转移上层水相（约0.6 ml）至1.5 ml 离心管中。
3. RNA 沉淀
1） 加入0.5 ml 异丙醇，混匀；
2） 室温放置10 min；
3） 4℃，12,000 rpm 离心10 min；
4） 弃上清，沉淀以1 ml 75%乙醇洗涤；
5） 4℃，10,000 rpm，离心10 min；
6） 沉淀于室温晾干（约5-10 min）。
4. 溶解RNA
15
1) 以10～50 μl 0.1% DEPC 水溶解，若不马上使用，以1/10 体积3MNaAc (pH 5.0)，2.5 倍体积无水乙醇沉淀，于-70℃贮存；
2) 定量：取1-3 μl 稀释至800 μl，测定OD260 及OD280。
D260/OD280=1.8～2.0
1 OD260= 40 μg/ml RNA
【注意事项】
1. 试剂均由0.1% DEPC 水配制。
2. 提取过程中所有材料(tube，tip)均为RNase free。
3. 操作过程中勤换手套，避免RNase 污染。
首页
