2、将长、短玻璃板分别插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
4、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
5、竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。
（二）配胶及凝胶板的制备
1．配胶
根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表16-5和表16-6。
表16-5 SDS-不连续体系凝胶配制
电极缓冲液为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%SDS。
电极缓冲液为0.1mol·L-1 pH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。
2．凝胶板的制备
（1）SDS- 不连续体系凝胶板的制备
●分离胶的制备：按表16-5配制20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约
8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
●浓缩胶的制备：按表16-5配制10ml3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置20—30min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3
Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约 0.5cm以上，即可准备加样。
（2）SDS-连续体系凝胶板的制备：按表16-6配制20ml所需浓度的分离胶，用细长头滴管将分离胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加入蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min，凝胶聚合，继续放置20—30min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。
（三）样品的处理与加样
1．样品的处理
根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂生产的低分子量标准蛋白试剂盒，每一安瓿则需加入200μL样品溶解液，自己配制标准及未知样品，按.5—1mg/1mL样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧以免加热迸出），在100℃沸水浴中保温3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可入在—20℃冰箱保存较长时间，使用前在
100℃沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合。
2、加样
一般每个凹形样品槽内，只加一个种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10—15μL（即2—10μg蛋白）。如样品较稀，加样体积可达100μL。如样品槽中有所泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。
（四）电泳
分离脉聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA60—120min。
1．连续系统
在电极槽中倒入0.1%SDS pH7.2
0.1mol/L磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至50mA，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1—1.5cm处，停止电泳，一般需5—6h。
2．不连续系统
在电极槽中倒入pH8.3Tris-HCl
电级缓冲液，内含0.1%SDS即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境，如需要电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续SDS-PAGE。开始时电流为10mA左右，待样品进入分离胶后，改为
20—30mA，当染料前沿距硅橡胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。
（五）凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定守液。
（六）染色与脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
（七）结果与分析
1．绘制标准曲线
将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图18-6所示。按下式计算相对迁移率mR：
以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。
2．根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。
3．分析各蛋白质相对迁移率高氏主要是由什么决定的？
注意事项
（1）由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3—4h或0.2mol/L
KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
（2）安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。
（3）在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
（4）电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。
（5）SDS纯度：在SDS- PAGE中，需高纯度的SDS，市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g
SDS放在圆底烧瓶中，加300mL无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min，用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至—20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量—20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。
（6）用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温3—5min，以免有亚稳聚合物存在。
（7）标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2—0.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。
（8）对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10—15μL为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。
（9）由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直到SDS脱尽（约需2—3天（，才可制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。
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