8.将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理，两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
①. 封闭， 2min.→
②. 抗体结合， 3min.→
①. 封闭， 1min.→
③. 洗膜, 1min. →
④. 平衡， 1min. →
⑤. 显色反应（黑暗），5－30min.
9.显色反应30min.即停止反应（延长显色反应时间，会增加背景而影响结果比较），用水漂洗测试条，将其置于3mm Whatman滤纸上空气干燥，然后在光下检测。
结果评估
显色反应进行5～10min.时，对照测试条中300pg浓度的样点即会出现颜色，30min.时3pg的样点也可见颜色，随即停止颜色反应。漂洗后比较对照与待测样品颜色，根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。
如果标记物浓度低于10－30pg则不适宜采用这一快速检测方法。
方法二、用 DIG标记的RNA对照比较检测
试剂：DIG标记的对照RNA（浓度约为100μg/ml）其它试剂同方法一
试验程序
1.将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl（5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度：
编号 对照RNA稀释方法 终浓度
A 20ng/μl RNA 2μl＋RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μl
B A 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C B 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
D C 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μl
E D 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μl
F E 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl
* 稀释后的A－E可以在-70℃下至少贮存一年。
2.按照同样的方法将待测的DIG－RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3.取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，第一排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C－F浓度进行检测。
4. 用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。
5.将膜置于封闭液中，室温下封闭30min.。
6.准备抗体溶液：用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。
7.将膜置于抗体溶液中，室温下保持 30min.，注意抗体溶液必须没过膜。
8.室温下用洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.。
9.再将膜置于检测缓冲液中2min.。
10. 在10ml检测缓冲液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成显色底物溶液（现配现用）。
11.除去检测缓冲液，加入显色底物溶液，在黑暗下显色大约16小时（一般几分钟即可见开始显色），注意在显色过程中，切勿振荡样品盘。
12.当颜色沉淀充分后，停止显色反应，用TE缓冲液或无菌水洗膜5min.。
13.比较对照和样品的颜色测算浓度。
六、Northern 印迹杂交
A. 探针准备
DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/
ml、3μl/ ml、5μl/ ml
…），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用
CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件
对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝
甲酰胺（去离子）
70% 乙醇
SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)
用1mol/L HCl调整至pH 7.0
Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)
用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml
于-20℃保存。
预杂交溶液：5× SSC
5× Denhardt 溶液
50%(w/v) 甲酰胺
1%(w/v) SDS
100μg/ml 鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入）
杂交溶液：DIG-RNA探针用预杂交液稀释成适当浓度
2×洗膜缓冲液：2×SSC 加入0.1% SDS
0.5×洗膜缓冲液：0.5× SSC加入0.1% SDS
0.1×洗膜缓冲液：0.1× SSC加入0.1% SDS
D. Northern转膜
转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法，根据需要选用适当的 分子量Marker.
1.在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
2.构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
3.用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。
4.剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。
5. 取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。
在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。
6. 拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。
7.取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。
8.交联：方法1. 将膜夹于两张滤纸之间，在80℃真空烘烤0.5～2小时；方法2.
将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。
对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。
9.转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。可见明显的 5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。
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