试验程序
1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的 DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次（切勿振荡），再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。
4.在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。
5.加入等量酚∶氯仿（1∶1），振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。
6.加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在 4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。

7.用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含 20μg/ml胰RNA酶（无DNA酶）的TE重新溶解质粒DNA，取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。

B. 质粒DNA的线性化

试剂及其配制
Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿（1∶1）
3mol/L NaAc(pH 5.2)
100%和70% 乙醇
DEPC-H2O

试验程序

Sal I或Not I 2μl(10U/μl)
2.37℃保温反应2小时以上。
3.消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4.将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5.4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。
6.线性化质粒DNA按 0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。
五、RNA探针制备（根据the DIG system user's guide）

A. 地高辛标记的体外转录

试剂及其配制（试剂盒提供）：
10× NTP标记混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)
10mmol ATP
10mmol CTP
10mmol GTP
6.5mmol UTP
3.5mmol DIG-UTP
10× 转录缓冲液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0)
60mmol MgCl2
100mmol DTE(dithioerythritol)
20mmol亚精胺
100mmol NaCl
1unit/mlRNase抑制剂。
10unit/μl DNase I (RNase-free)
20unit/μl Rnase抑制剂
20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶
4mol/L LiCl
200mmol/L EDTA
DMPC-H2O
试验程序（带手套操作）
1.在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物（离心管置于冰上）：线性化模板DNA 4μl(1μg)
10×NTP标记混合物 2μl
10×转录缓冲液 2μl
DMPC－H2O 10μl
T3或T7 RNA聚合酶 2μl
2.轻轻混匀反应物，37℃保温反应至少2小时。
3.如果必要，向反应体系中加入 2μl无Rnase污染的DnaseI，37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板（由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量，因此，这一步有时也可以省略）。
4.向反应体系中加入2μl 200mmol/L的EDTA终止转录反应。
5.再向反应体系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀过夜
6.4℃下，12000rpm离心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗涤一次，真空干燥。
7.沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H2O中（每一反应体系约10μg），并向其中加入 20unit Rnase抑制剂，置于-20℃保存备测，检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。
DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。
B. DIG标记有效性检测

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。

方法一、用标准DIG测试条比较鉴定

使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。

试剂及其配制
20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O(88g/L)
pH 7.0
RNA稀释缓冲液：DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中
BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中
DIG空白试剂条：带正电荷的尼龙膜
对照试剂条：在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样（300,100,30,10,3pg）
洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封闭液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA

试验程序（带手套操作）
1.将转录反应物稀释成浓度约为1μg/ml，即取前述转录标记物1μl加入99μlRNA稀释缓冲液，如果转录标记反应正常其浓度应大约为1μg/ml。
2.取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E顺序编号，将1μg/ml浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度：

编号 RNA标记物稀释方法 RNA终浓度
A 1μg/mlRNA 10μl＋RNA稀释缓冲液23μl 300pg/μl
B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C A 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 30 pg/μl
D B 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
E C5μl + RNA稀释缓冲液45μl 3 pg/μl

3.将空白测试条置于一聚酯膜上，以每一浓度1μl的量在测试条上点样，在聚酯膜上做好点样浓度标记，切勿直接在测试条上做任何记号，切勿用手接触测试条。
4.室温干燥约2min.，同时制备测试溶液。
5.在2ml 封闭液中加入1μl Anti-DIG-AP。
6.显色底物溶液：在2ml检测缓冲液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。
7. 准备5个样品池（2.5 ~ 5ml容量），1～6顺序编号，依次加入2ml以下溶液。
①. 封闭液；
②. 抗体溶液（第5项）；
③. ③④⑤洗膜缓冲液；
④. 检测缓冲液；
⑤. 显色底物溶液（第6项）