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生物化学实验的基本要求:实验的准确性

2020.9.07
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

生物化学实验是以活的生命体为对象,对生物体内存在的主要大分子物质,如糖、脂肪、蛋白质、核酸等进行定性或定量的分析测定。定性分析是确定存在物质的种类,或粗略计算物质所占的比例;而定量分析则需要确定物质的精确含量。因此分析工作者要根据实验要求对实验结果进行分析和总结,要善于分析和判断结果的准确性,认真查找可能出现误差的原因,并进一步研究减少误差的办法,以不断提高所得结果的准确度。
一般在实验测量过程中都会有误差产生,但在懂得这些误差的可能来源的前提下,多数的误差是可以通过适当的处理来校正的。
产生误差的原因很多,一般根据误差的性质和来源可把误差分为两类,即系统误差和偶然误差。
一、有效数字
做实验每天接触千千万万的数字,什么是有效数字?是否小数点后数字愈多愈准确?数字1、2、3、4、5、6、7、8、9 是有效数字。数字0 可以是有效数,也可能不是,如果零只用来表示小数点的位置时,它即不是有效数。例如,0.070080kg,这个数字的前两个零都不是有效数字,它们只是用来表示小数点的位置。如改用另一个单位,即可把它们取消,如采用克为单位,就可写成70.080g。7 和8 之间的两个零,是有效数字,如去除其中的两个零,数值就完全变了(0.0708 或0.0780kg)。最后一位零也是有效数字,它指出在该项称重中,可以测定到0.000010kg,只不过数字正好是零。如果将最后的零去除,则意味着重量只能称到0.00001kg。有效数字的位数说明一个测定的准确度,应当符合这个测定(包括这个测定的每一个步骤)总的准确度。在作一项测定(长度、重量、容积、光密度、时间、电流、电压等),进行一项计算或报告一项实验结果,在数值上都可包括一位估计的数字。例如用一刻度最小到毫米的尺来量一个长度时,可以估算到刻度的1/10,就是估计到0.1mm,如623.3mm,0.3 这个数是估计的,真实的数可能是623.1 或623.5mm,最后一个数字是有误差的。如计算一个乘数,如将3.625mg/ml,乘以1.26 时,在乘积中的值只能保留三位数字,因为乘积不可能比它原来的数字更为准确。又如将几个数值相加(0.410+0.1263+9.00,其和应是9.58,而不是9.5763,因为数的和不会比它准确度最差的一项为好。据以上的原因,在一个测定的各个环节中在可能范围内要注意应选择准确度相类似的仪器,否则在某一环节中使用了一次准确度很低的仪器,则整个测定结果的准确度便降低了。同样,在某一个实验环节使用了一次准确度很高的仪器,这种测量也是徒劳无功的,毫无意义。例如在滴定管的校正中,由于滴定管只能读到四位数字如32.18 时,水及称量瓶的重量也只需称到四位有效数字(如49.19g),虽然分析天平可称至有效数六位。也是无用的。这时可改用准确数四位的天平即可。
二、误差
误差即指一种被测物的测定结果与其真值的不符合性,真值往往是不能确切知道的,通常以多次测定结果的平均数来近似地代表真值。尽管实验的分析方法相当准确,仪器亦很精密,试剂纯度很高,操作者技术很熟练,然而这些都不能使某种物质的测定结果与其真值绝对相符。同一个样本多次重复测定,其结果亦不能完全相同。因此
实验中的误差是绝对的。根据误差的来源和性质,通常可分下述三大类。
1.系统误差
系统误差是指一系列测定值存在有相同倾向的偏差,或大于真值,或小于真值,一般是恒定的。多是由于某种确定的原因引起的,在一定条件下可以重复出现,误差的大小一般可以测出。经分析找出原因,可采取一定措施,减少或纠正。
(1)系统误差的来源
①方法误差:如用滤纸称量易潮解的药品;做生物实验特别是酶的实验时没有考虑温度的影响等。
②仪器误差:如量取液体时,按烧杯的指示线量取液体往往准确度降低,需要用量筒量取;在配置标准溶液时量筒同样不够精确,要选用等体积的容量瓶定容到刻度线;不同的天平其精度差别很大,如果需要称量100g 以上的物体,使用托盘天平即可,但如称量1g 的样品,选用扭力天平比较方便,称量10mg 以内的样品则必须使用感量为万分之一克的分析天平或电子天平称取。
③试剂误差:如试剂不纯或蒸馏水不合格,引入微量元素或对测定有干扰的杂质,就会造成一定的误差。
④操作误差:如在使用移液管量取液体时,由于每人的操作手法不同,可能会存在一定的操作误差。特别是在读数据时,目光是否平视,视线与液体弯月面是否相切,都可能成为生化实验中造成较大误差的主要原因。
2、系统误差的校正
①仪器校正:在实验前对使用的砝码、容量皿或其它仪器进行校正,对pH 计、电接点温度计等测量仪器进行标定,以减少误差。
②空白实验:在任何测量实验中都应包括有对照的空白实验。用同体积的蒸馏水或样品中的缓冲液代替待测溶液,并严格按照待测液和标准液同法处理,即得到所谓的空白溶液。在最后计算时,应从实验测得的结果中扣除从空白溶液中得到的数值,即可得到比较准确的结果。
2.偶然误差
与系统误差不同,误差的大小,正负是偶然发生的。误差时大时小,时正时负,不固定,一般不可预测。分析的步骤愈多,出现这种误差的机会愈多,所以也不易控制。如遇到这种情况时,应对仪器、试剂、方法作全面的检查。一般生物类实验的影响因素是多方面的。常常由于某些条件,如温度、光照、气流、反应时间、反应体系的微小变化都会引起较大的误差。特别是某些因素的作用机理目前仍不十分清楚,所以有些实验结果重现性较差。
偶然误差初看起来似乎没有规律性,但经过多次实验,便可发现偶然误差分布有以下规律。一是正误差和负误差出现的几率相等;二是小误差出现的频率高,二大误差出现的频率较低。因此解决偶然误差主要可通过进行多次平行实验,然后取其平均值来弥补。测试的次数越多,偶然误差的几率就越小。
3.责任误差
这种误差是由于工作人员工作态度不严肃,责任心不强,思想不集中,操作粗校大叶所引起的,这种误差是可以避免的。对于初做生物化学实验的工作者来说是经常发生的。如加错试剂、在配置标准溶液时固体溶质未被溶解就用容量瓶定容、在称量样品时未关升降扭就加砝码、在做电泳时点样端位置放错、在做抽滤实验时应留滤液
却误留滤渣、在作图时坐标轴取反以及记录和计算上的错误等。这些失误会对分析结果产生极大的影响,致使整个实验失败。所以在实验中一定要避免操作错误,培养严谨和一丝不苟的科学实验作风,养成良好的实验习惯,减少失误的发生。

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