生物化学实验的基本操作-2

二、一般操作技术
1、混匀法：欲使一化学反应充分进行，必须使反应体系内各种物质迅速地相互接触，因此除特别规定外，一般都需要将反应物彻底混匀。混匀方式大致有以下几种，可随使用的器皿的液体容量而选用。
（1）旋转混匀法：手持容器作离心旋转，适用以未盛满液体的试管或小口器皿，如三角瓶等。
（2）弹指混匀法：左手持试管使之直立，以右手食指轻击试管之下部，使管内溶液作旋转流动。
（3）倒转混匀法：适用于有玻璃塞的瓶子，如容量瓶等。
（4）弹动混匀法：以右手大拇指、食指、中指握住试管上部，将试管放平，于左手掌中弹动。
（5）吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸放数次，适用于量少而无沉淀的液体。
（6）搅拌混匀法：适应烧杯等大口容器所盛之溶液的混匀，一般在配制混合试剂时，用玻棒搅拌以助溶，或混匀大量的溶液。
2、保温与加热：为使某一化学反应在一定的温度下进行，常需要保温；为促进或停止化学反应，有时需要加热。
（1）保温：常用恒温箱或恒温水浴进行，后者的温度较前者稳定。
（2）加热：加热常用两种方法，一是直接把试管、烧杯等器皿在酒精灯、电炉或煤气火焰上加热；二是在水浴中加热或煮沸，应根据实验的目的而定。
3、过滤：过滤的目的是将沉淀与液体分开，可用滤纸、棉花、纱布等。生化实验中所进行的过滤，为了不改变溶液的浓度，一般不要用水湿润滤纸。过滤所用的滤纸常摺成多摺状，以增大过滤面积。当过滤难滤之物或为了加快速度，可采用减压抽滤法。实验室中有时用离心法代替过滤。
三、实验样品的制备
在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，还是研究组织中物质代谢的过程，皆需利用特定的生物样品。为了达到一定的实验目的，往往需要将获得的样品预先做适当的处理。掌握实验样品的正确处理方法乃是做好生物化学实验的先决条件。
基础生物化学实验中，最常用的动物或人体样品是全血、血清、血浆及无蛋白血滤液。组织样品则常用肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等，实验时可制成组织匀浆、组织糜、组织切片或组织浸出液等形式。有关这些组织样品的制备方法，扼要介绍如下：
（一）血液样品
全血：无论是收集动物还是人的血液，均应注意仪器的清洁与干燥，同时也要及时加入适当的抗凝剂以防止血液的凝固。一般在血液取出后，迅速盛于含有抗凝剂的器皿中，同时轻轻摇动，使血液与抗凝剂充分混合，以免形成小凝块。取得全血如不立即进行实验，应储存于冰箱内。
常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠及肝素等，可视实验要求而选用。一般实验用草酸盐即可，但它不适用于血钙测定。氟化钠因兼有抗凝及抑制糖酵解之作用，故可用于血糖测定。但因其也能抑制脲酶，故用脲酶测定尿素时，则不能应用。肝素虽好，但价格较贵。

抗凝剂的用量不应过多，否则影响实验结果。通常每毫升血液加1~2mg草酸盐或5mg柠檬酸钠或5~10mg氟化钠，肝素仅需要0.01~0.2mg，最好抗凝剂制成适当浓度的水溶液，然后取 0.5ml置于准备盛血的器皿内，再横放蒸干（肝素不宜超过30℃），则抗凝剂在器皿壁上形成一层薄膜，使用时较为方便，效果较满意。
血浆：上述抗凝的全血在离心机中离心，所得的上清液即为血浆。如需用血浆进行分析时，必须严格防止溶血，故采血时一切用具（注射器、针头、试管等）皆需清洁干燥，取出的血液也不能剧烈振摇。
血清：收集的血液不加抗凝剂，在室温下放5~20分钟即自行凝固。通常经3小时，血块收缩，析出清亮的血清。为了节省时间，必要时可离心分离血清。制备血清同样须防止溶血。

无蛋白血滤液：分析血液中许多成分时，也常除去蛋白质，制成无蛋白血滤液。如血液中的非蛋白氮、尿酸、肌酸等测定皆需先把血液制成无蛋白血滤液后，再进行分析测定。蛋白质沉淀剂如钨酸、三氯醋酸或氢氧化锌皆可用于制备无蛋白血滤液，可根据不同的需要而加以选择。
（二）尿液样品
一般定性实验只需将尿收集一次即可，但一天之中各次排出尿液的成分随食物、饮水及一昼夜的内生理变化等的影响而有很大的差异，因此定量测定尿液中各种成分皆应收集24小时尿混合后取样。通常在早晨一定时间排出残余尿而弃去，以后每次尿皆收集于清洁大玻瓶中，到第二天早晨同一时间收集最后一次尿即可，随即混合并用量筒量准其体积。
收集的尿液如不能立即进行实验，则应置于冷处保存。必要时可在收集尿时即于收集的玻瓶中加入防腐剂如甲苯、盐酸等，通常每升尿中约加入5ml甲苯或5ml盐酸即可。
如须收集动物尿液，可将动物置于代谢笼中，其排出之尿液经笼下漏斗流入瓶中而收集之。
（三）组织样品
离体不久的组织，在适宜的温度及ｐH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织，研究各种物质代谢的途径与酶系的作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。
但是各种组织离体过久后，都要发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后发生变性而失活。有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟内，其含量即有明显的降低，因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需之脏器或组织，去除外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷之生理盐水洗去血液，必要时也可用冰冷之生理盐水灌注脏器以洗去血液，再用滤纸吸干，即可作实验之用。取出的脏器或组织，可根据不同的目的，用以下不同的方法制成不同的组织样品。
组织糜：将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机绞成糜状即可。
组织匀浆：新鲜组织称取重量后剪碎，加入适当的匀浆制备液，用高速电动匀浆器将组织研磨成匀浆。为了降低研磨产生的热量，使组织及酶不致变性，制备匀浆时一般应将玻璃匀浆管插入冰水浴中，适当控制研磨的速度。
玻璃匀浆管是一种特制的厚壁毛玻璃管和一个一端带有磨砂玻璃杵头的研磨杆组成。规格大小不一，使用时可根据需要进行选择。