实验原理
在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
试剂和器材
一、试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000mL容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容至 1000mL。
葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100mL,即含葡萄糖为2.0mg/mL。
6mol/L HCl:取250mL浓HCl(35%~38%)用蒸馏水稀释到500mL。
碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。
6mol/L NaOH:称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
二、材料
藕粉,淀粉。
三、器材
试管1.5×15cm(×13), 3.0×20cm(×1);移液管0.2mL(×2),0.5mL(×2),1mL(×5), 10mL(×1);水浴锅;电炉;分光光度计。
操作方法
一、葡萄糖标准曲线制作
取6支1. 5 cmm×1.5cm试管,按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。
管号 |
葡萄糖标准液(mL) |
蒸馏水(mL) |
葡萄糖含量(mg/mL) |
A540 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
1 |
0.2 |
0.8 |
0.4 |
|
2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
|
3 |
0.6 |
0.4 |
1.2 |
|
4 |
0.8 |
0.2 |
1.6 |
|
5 |
1 |
0 |
2 |
在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL,于沸水浴中加热2min进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0mL,摇匀,在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。二、样品中还原糖的提取
准确称取0.5g藕粉,放在100mL 烧杯中,先以少量蒸馏水调成糊状,然后加入约40mL蒸馏水,混匀,于 50℃恒温水浴中保温20min,不时搅拌,使还原糖浸出混。过滤,将滤液全部收集在50mL的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。
三、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g淀粉,放在大试管中,加入6M HCl 10mL,蒸馏水15mL,在沸水浴中加热0.5h,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6M NaOH溶液中和至溶液呈微红色,并定容到100mL,过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于总糖测定。
四、样品中含糖量的测定
取7支15mm×150mm试管,分别按下表加入试剂:
项目 |
空白 |
还原糖 |
总糖 |
||||
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
样品溶液(mL) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
3,5-二硝基水杨酸试剂(mL) |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
A540 |
加完试剂后,于沸水浴中加热2min进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0mL,摇匀,在 540nm波长处测定光吸收值。测定后,取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。
五、计算
按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量:
式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/mL;
V──还原糖或总糖提取液的总体积,mL;
m──样品重量,g;
1000──mg换算成g的系数。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色。