三．主要试验环节的操作
3.1 酵母菌株的分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养
TOP10F’做为菌种保存在－70 ℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。
接种TOP10F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养16～18小时。
3.3毕赤酵母表达的试验方法
3.3.1 线状质粒DNA的脱磷酸化处理
为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：
⑴ 建立反应体系：
线性化的质粒 35ul
10x CIP buffer 4ul
CIP 1ul
ddH2O 5ul
———————————
total 45ul
⑵ 在PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（灭活）。
⑶ 在56℃未开始前停止，加入proteinse K ，用于灭活CIP，加入试剂如下：
反应物 45ul
10x 5％ SDS 7ul
10x EDTA （pH 8.0） 7ul
proteinse K 5ul
ddH2O 6ul
—————————————
total 70ul
⑷ 纯化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3步骤进行，20 ul 灭菌ddH2O洗脱纯化产物。进行1％琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计DNA浓度。
3.3.2 E.coli TOP10F’ 感受态细胞的制备及转化
⑴ 取10 ul TOP10F’ 菌液，接种于 200ml LB液体培养基中活化培养，37℃ ，200 rpm，16～18小时。取100 ul菌液接种于 200 ml 液体LB培养基中。
⑵ 37℃ ，200 rpm，培养16～18小时。
⑶ 灭菌500 ml 离心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。
⑷ 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。
⑸ 从制得得感受态细胞中，取200 ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物 5ul ，混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5 min。
⑹ 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。
⑺ 使用电击穿孔仪进行转化，设置为 电压 2500 V，时间 5 ms。
⑻ 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。
⑼ 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。
*注：设空载体做对照。
3.4 毕赤酵母电转化方法
3.4.1 菌体的准备：
1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；
2. 取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到 1.3~1.5；
3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
4. 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
5. 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6. 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；
7. 备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。
3.4.2 电击转化：
8. 将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；
9. 将电转化杯冰浴5min；
10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；
11. 电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；
12. 将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600μl涂布一块平板；
13. 将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
推荐：电压 1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。
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