毕赤酵母电转化

实验概要

本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。与去壁细胞效率相似。

实验步骤

1. 细胞准备：

   1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。

   2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。

   3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

   4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

   5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

   6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。

注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。

2. 转化：

   1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。

   2) 在冰上放置5min。

   3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。

   4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。

   5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。

   6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。