10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml 牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）
该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。
另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商（除New
England
Biolabs公司外）现在都用Weiss等，11968)对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和
Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England
Biolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par
目前提供的Ｔ4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L
KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ4噬体DNA连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。
３）每个样品各取1－2μl转化大肠杆菌感受态细胞。
（三）平端DNA连接
Ｔ4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和
Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：
1）低浓度（0.5mmol/L）的 ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
2）不存在亚精胺一类的多胺。
３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。
4）高浓度的平端。
1．凝聚剂
在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT
Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：
1）它们可使平端DNA的连接速率加大1－３个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。
2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。
（1）聚乙二醇（PEG8000）
1）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG
8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG
800和Ｔ4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0℃混合，然后加适当体积的PEG
8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。
2）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和 Zimmerman,1983）。
３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。
4）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。
（2）氯化六氨合高钴
1）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L
时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-
Flanders,1985）。
2）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将点尽优势。
３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。
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