2.包涵体的分离与纯化
细胞破碎时提取细胞内产物的关键。对于细菌的裂解常用的有酶溶法、超声破碎法、化学渗透法、玻璃珠研磨等。包涵体可通过超声波、匀浆等常规的方法是菌体破碎后，离心就可得到。密度梯度离心后可得到高纯度的包涵体。包涵体一般不溶于水，为了获得可溶性的蛋白质可加入强蛋白质变性剂后使其溶解。一般有盐酸胍（5～8mmol/L）、尿素(5～8mmol/L)等，也可用酸性溶液直接溶解包涵体，使非共价聚集的蛋白质分子间分离；若包涵体内蛋白质多肽链中含有半胱氨酸时，可采用低pH值加含巯基的试剂巯基乙醇或二硫苏糖醇和适量的SDS，使蛋白质完全还原，呈溶解状态。
3.包涵体的复性
包涵体中蛋白质必须恢复其生物活性，称为包涵体蛋白质的复性，通过逐步降低变性剂浓度，可使表达蛋白恢复其天然构型。复性效率与蛋白质的纯度和浓度、残留变性剂的浓度、复性时溶液的pH值、离子强度、温度等许多因素有关。常用的复性的方法有逐步稀释法或透析。
大肠杆菌表达系统在实际应用中存在着一些不足之处，由于缺乏转录加工的机制，因此只适合表达克隆的cDNA, 不宜表达真核基因组DNA；由于缺乏适当的翻译后加工机制，大肠杆菌表达系统表达的真核蛋白质不能形成一定的折叠、修饰，只适宜表达翻译后不需进行加工的真核蛋白，或不进行翻译后加工不影响生物学活性的真核蛋白；大肠杆菌表达系统表达的真核蛋白质往往形成不溶性的包涵体，需经过变性、复性处理，才能恢复生物学活性；利用大肠杆菌的分泌信号，可将外源蛋白分泌到细胞间隙或细菌培养液中，但很难大量表达分泌性蛋白，产量不高；表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏。
二、真核表达体系
与原核表达体系相比，真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞表达体系显示了较大的优越性。
（一）酵母表达体系
酵母表达系统中最常用的啤酒酵母，酵母是单细胞真核生物，具有真核细胞的特点，可以对蛋白进行多种翻译后修饰，如蛋白的糖基化；能进行所设计的翻译后修饰，例如正确的二硫键的形成和信号肽的蛋白质水解；酵母的培养简单，无需特殊的培养基，培养基中没有蛋白质的加入；酵母自身的分泌蛋白很少，能把外源基因产生的蛋白质分泌到培养基中，便于分离纯化，是一个理想的分泌型表达系统；啤酒酵母具有较高的安全性，没有内毒素，无致病性。现在已分离得到几个较强的酵母基因启动子，可以调控基因进行高效表达；总之，酵母表达系统具有一个产量高，分泌型的特点，先后成功表达了多种干扰素、人表皮生长因子、人乙型肝炎表面抗原和核心抗原等。
1.酵母表达载体
是在酵母克隆载体的基础上带上一定的表达结构而成的。一般情况下表达载体均是质粒型,并且是穿梭载体,即它们都含有在酵母细胞和大肠杆菌细胞中发挥作用的可选择遗传标志和复制子。这些穿梭载体再插入一些表达结构包括酵母启动子和一个或多个供外源蛋白质编码序列插入的限制性酶切位点，转录的起始序列、转录终止序列和编码有用的蛋白质结构域的序列。
(1)选择性标志: 选择性标志通常选用的是野生型基因，如URA3、LEU2、HIS3和TRP1。这些基因可以补偿酵母细胞某一特定的代谢缺陷（营养缺陷）。这些标志和细菌质粒中的抗生素标记不同，它们必须与具有可被互补的适当突变宿主菌株结合。这些选择性标志基因往往插入大肠杆菌质粒载体中构成整合型质粒。
(2)复制子: 大多数酵母表达载体源于2μm环的克隆载体。2μm环是一种在酿酒酵母中天然存在的一种内源性质粒DNA，是1967年美国芝加哥大学的Sinelari发现的，长度为2μm。2μm质粒一般存在与细胞核中，在每个细胞中平均拷贝数是50-100，能稳定存活于细胞中，它的复制和染色体的复制通常是同步的，都发生S期。带2μm环的克隆载体是在整合型质粒插入2μm质粒的复制起始点构成的。
(3)常用的启动子: 外源基因在酵母细胞中表达，在酵母克隆载体的基础上，一定要带有酵母基因的启动子，常用的酵母基因启动子有：醇脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶，蔗糖酶，酸性磷酸酯酶和酵母交配因子（MFα）。
(4)上游活性序列: 酵母各类基因中，它的上游普遍存在着一段活性序列，它的作用类似于哺乳动物细胞基因的增强子。上游活性序列位于转录起始点上游几百个碱基处，它的激活能促进转录。
(5)终止序列: 在酵母表达载体在启动子和克隆位点均含有翻译的终止学列，它可引起RNA聚合酶II终止转录。另外更重要的是，启动子下游转录终止序列的出现可增加mRNA的数量和蛋白质表达的总量。
(6)有用的蛋白结构域: 许多表达载体在启动子的下游带有编码有用蛋白质结构域的DNA序列。这些结构域有：信号肽序列，可引导表达产物分泌到细胞外培养基中；核定位序列，可引导表达产物运送到细胞核中。
2.酵母表达外源性基因的形式
酵母表达外源性基因的形式有直接表达和分泌性表达二种。直接表达外源性蛋白是指外源蛋白质表达后积累于酵母细胞质中不分泌出来。比较成功的例子是人乙型肝炎表面抗原在酵母细胞内的表达。分泌性表达是指蛋白质在酵母细胞中表达后，为了便于糖基化以及纯化的方便，往往利用一些酵母分泌型表达载体最终能产生信号肽，将外源蛋白质分泌于细胞外或培养基中，实现外源表达基因的分泌。这些分泌型表达载体带有的分泌信号序列通常是带有α因子前导序列的，它以酵母细胞为受体细胞，组成酵母外源性蛋白分泌表达系统。α因子是由13个氨基酸残基组成的多肽。它首先一前体的形式表达，这个前体由165个氨基酸组成，包括89个氨基酸组成的信号肽，信号肽的分泌、表达可以介导外源性蛋白的分泌表达。因此，将编码α因子信号肽的DNA片段插入在一个适合的酵母启动子的下游，构建酵母细胞分泌表达系统。
（二）哺乳动物细胞表达体系
哺乳动物细胞表达系统是指采用某种方式将外源基因导入细胞，在哺乳动物细胞中表达获得一定的有用的蛋白质，这一类真核基因的表达系统称为哺乳动物细胞表达系统。哺乳动物细胞不仅可以表达克隆的cDNA，而且还可以表达真核基因组的DNA；哺乳动物细胞表达的蛋白通常可以被适当的修饰，而且表达的蛋白质回恰当地分布在细胞的一定区域并积累。哺乳动物细胞表达系统的最大缺点是操作技术难、费时、不经济。
常用的哺乳动物细胞表达载体
有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。
(1)原核DNA序列：
为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，不哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。当具备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。
(2)启动子： 真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bpd到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。启动子的转录销路因细胞而异。因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。
(3)增强子： 增强子是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远是仍有活性。许多增强子只能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。
(4)剪接信号： 真核基因由许多内含子和外显子组成。被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。一般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能回影响邻近拼接位点的使用效率，在替换外显子是应注意。
(5)终止信号和多聚腺苷化的信号： 转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。为了保证目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表达载体上必须包括多聚腺苷化下游的一端序列。最常用的方法是用SV40的一端237bp长的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信号。另一种的方法是将全长 cDNA与已组装在表达载体上一个顺式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信号。
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