DNA重组（DNA recombination）技术：外源基因的蛋白表达-4

（3）CHO细胞稳定表达系统：动物细胞瞬时表达系统中外源基因没有稳定地整合到宿主细胞染色体中，一染色体外DNA的形式存在。因而只能瞬时表达。要使外源基因在宿主细胞中高效、稳定地表达，必须建立一个稳定表达系统，包括适宜的表达载体、有效的基因转染、标记基因和目标基因的选择与共扩增、受体适当的受体细胞和培养条件。现以pMT2为载体，二氢叶酸还原酶（DHFR）未标记基因， CHO细胞为受体细胞，介绍哺乳动物细胞稳定表达系统。
pMT2在哺乳动物细胞稳定表达系统中和瞬时表达系统中有所不同，区别在此表达载体中含有鼠的DHFR基因序列，作为选择标记基因，并在动物细胞内可进行扩增。pMT2表达载体既可在瞬时表达系统中起作用，又可在稳定表达系统中稳定表达外源基因。

选择性标记基因的作用就是为带有外源基因的哺乳动物细胞提供选择标记。作为选择性标记基因必须和目的基因一起转染细胞，并在细胞中进行扩增，然后作为标记获得含有目的基因的细胞。DHFR时目前应用得比较广泛的选择性标记基因。DHFR的作用指催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。当叶酸的类似物氨基喋呤和氨甲喋呤（methotrexate,MTX）存在时，可与叶酸竞争结合DHFR并抑制DHFR的活性，使细胞死亡。当细胞中DHFR基因大量扩增，并有高表达时，MTX不足以竞争结合全部的DHFR，使细胞在含有MTX的培养基中可存活。利用这一特点，和外源基因共同扩增的DHFR基因可利用它对MTX的抗性，筛选出含目的基因的细胞。
一般选用DHFR基因缺陷的CHO细胞，便于筛选目的基因。CHO细胞适用于多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；有对培养基的适应性强的特点；可进行大量的培养，大规模生产。

外源基因的转染方法可选用磷酸钙共沉淀方法、聚乙二醇介导的细胞融合法以及电穿孔导入法等。要想得到长久稳定表达的细胞系，必须对转入的目的基因及可扩增的选择性标记基因通过增加选择物的浓度（DHFR基因通过增加MTX浓度），使外源基因进行扩增，并稳定地整合入宿主细胞的染色体上。当细胞在没有选择物的情况下，得到扩增的基因可以稳定存在下去。
三、表达产物的分离、纯化与鉴定
（一）大肠杆菌重组表达蛋白的分离、纯化
大肠杆菌的分泌型蛋白和融合型蛋白的纯化有所不同，分泌型表达蛋白的纯化必须通过细胞的溶解、包涵体的分离、变性和折叠复性等步骤；而融合型表达蛋白除了以上个步骤外，由于是融合蛋白，所以必须在包涵体分离、变性以后在进行定点裂解以释放重组的多肽并折叠复性。
1.大肠杆菌重组表达蛋白质分离的粗制品
一般步骤包括：离心收集菌体→ 超声波破碎→离心收集上清 →热处理变性→离心→上清用硫酸铵沉淀。
大肠杆菌经过离心浓缩以后可用机械磨碎法、超声波处理法或溶菌酶加去污剂法将包涵体分离。在大肠杆菌表达产率过高，超出大肠杆菌的代谢水平时，表达产物累积起来，高浓度导致形成多聚体，然后形成包涵体。包涵体的形成和溶液pH值和蛋白质本身的溶解度有关；和蛋白质之间的离子键、疏水键或共价键等化学作用有关；和高温培养条件有关。包涵体是蛋白质的聚合体，包含了表达的目的基因产物、大肠杆菌菌体蛋白成分、质粒编码的蛋白、其他污染成分。溶解包涵体常用的变性剂有尿素、盐酸胍、SDS等。一般的情况以超声波处理方法为主。
对于融合蛋白来说，除了对包涵体的处理以外，还必须使其重组蛋白从中释放。由于融合蛋白通常可以得到高效表达，且比较稳定，融合蛋白比多数菌体蛋白大，因此电泳中易于鉴定。尽管融合蛋白可大量产生，又易于纯化，但在分离纯化过程中必须进行定点裂解，以获得感兴趣的重组蛋白。定点裂解可用溴化氢裂解或蛋白酶水解方法。

重组蛋白的从包涵体中释放是缺乏生物学活性的；一系列的纯化过程中，处理的条件比较剧烈，使蛋白质高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别重要。蛋白质复性的原则是恢复其高级结构，并使之稳定，一般低浓度的尿素（3mol/L尿素），可使变形的蛋白质重新折叠。复性前提是蛋白质必须达到一定的纯度，另外还与蛋白质的浓度、温度、pH值及氧化还原剂条件等密切相关。
2.大肠杆菌重组表达蛋白质分离的精制品
大肠杆菌重组表达蛋白质分离的粗制品要经过凝胶层析、离子交换层析的纯化，获得相对的纯品，获得的纯品然后还需经过活性、纯度、和序列的测定加以确定。
（二）酵母重组表达蛋白的分离、纯化
酵母重组表达蛋白的分离、纯化分为两种情况：酵母细胞内表达的蛋白质和蛋白分泌型：
1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化
酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化的过程比较简单，以α-蛋白酶抑制剂的纯化为例：收集酵母细胞→用玻璃珠破碎 →离心取上清→DEAE Sepharose层析柱→用0-0.3mol/L NaCl梯度洗脱→收集活性部分，浓缩→SephadexG75层析→收集活性部分，浓缩→SDS-PAGE纯度鉴定达95%以上。
2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离纯化
以酵母表达干扰素纯化为例：
发酵液用0.45μm孔径的Milipore滤膜过滤浓缩→DEAE-Trisacryl
层析柱→用0-0.3mol/L NaCl梯度洗脱→收集干扰素部分→SephadexG75凝胶过滤→用50mmol/Limidazole，pH6.8洗脱 → 收集干扰素 →用水稀释1倍→层析聚焦（Pharmacia,PBE94）缓冲液洗脱→干扰素电泳鉴定，纯度大于95%，N-末端序列正确，二硫键结构和天然一致，总回收率为13%。
提高酵母表达系统重组蛋白的产量的方法是解聚技术：把聚合体变为单体的技术，相当于大肠杆菌的包涵体处理技术。聚合体在变性的条件下（4mmol/L尿素处理），凝胶过滤可得到较好的层析峰。SDS、加热也不失为一种解聚的方法。
（三）CHO细胞的表达重组蛋白的纯化、鉴定
CHO细胞收集、离心→取上清，加EDTA，贮存与-20℃→离子交换层析（S-Sepherose）→收集洗脱NT-3→洗脱液用超滤方法浓缩→凝胶过滤（Sephacryl S-100HR）→收集层析峰（含NT-3部分），并进行浓缩 →上反相HPLC层析柱（C18）→SDS-PAGE纯度鉴定→HPLC层析峰中含NT-3部分进行序列分析。
（四）重组蛋白质分析鉴定基本要求
重组蛋白质的鉴定方法一般可以通用，但要根据不同的蛋白质选用其中部分进行运用：

重组蛋白质的鉴定方法及标准