(三)DNA酶切片段的回收
【实验方法与步骤】
1.冻融法:
(1)在UV灯下,用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下,-70℃冷冻至少 15min,然后在65℃水浴中使胶融化;
(2)加入等倍体积TE-饱和酚,剧烈振荡30秒钟,然后-70℃冷冻 15min;
(3)室温融化后,12,000rpm离心5min,将上层水相移至另一离心管中,用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L
NaAc(pH5.2)沉淀DNA片段,离心后的沉淀用75%乙醇漂洗一次,室温干燥DNA,用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA后,-20℃保存备用。
2.低熔点琼脂糖法:
(1)在UV灯下,用手术刀片在待回收DNA片段前方挖一槽,然后用同样浓度的低溶点琼脂糖将槽填平,继续电泳至待回收DNA片段进入低熔点琼脂糖中;
(2)在UV灯下,用手术刀片将含DNA的低熔点琼脂糖凝胶切下,37℃水浴 10min至凝胶融化为止;
(3)加入等体积的TE饱和酚/氯仿(1:1)抽提,12000rpm离心 5min;
(4)将上层水相移至另一离心管中,用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积 3mol/L NaAc(pH5.2)沉出、75%乙醇漂洗一次,晾干备用。
3.DNA回收试剂盒(玻璃乳法):
(1)在UV灯下,从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶,放入一离心管中;
(2)加入3倍体积的6mol/L NaI溶液,45~55℃水浴5~10min使胶完全融化;
(3)加入10?滋l玻璃乳悬液,轻弹管底混匀,然后45~55℃水浴 5~10min,期间每2~3min混匀一次;
(4)5000rpm离心30~60秒,弃上清;
(5)加400?滋l漂洗液(20mM Tris.Cl,pH7.4/1mM EDTA/100mM NaCl和等体积无水乙醇),轻弹管底混匀,然后同上离心弃上清;
(6)再加入漂洗液,轻弹管底混匀,然后同上离心弃上清,并用加样器尽量除净漂洗液,然后室温晾干;
(7)加10~30?滋l无菌双蒸水或TE缓冲液将玻璃乳悬浮起来,45~55℃ 水浴5~10min;
(8)10000rpm离心1~2min,回收上清备用。
【注意事项】
漂洗玻璃毛时不可用加样器上下吹打,从玻璃毛上洗脱DNA时则相反。
五、载体与DNA片段的连接反应
【实验目的】
学习和掌握DNA连接酶的使用原则和基本方法
【实验原理】
DNA连接酶可以在两个双链DNA分子相邻的5'-磷酸与3'-羟基之间形成磷酸二酯键,从而可以实现重组DNA分子的构建。一般在连接反应之前,DNA分子都要进行限制性内切酶消化,使待重组的DNA分子具有相匹配的末端,黏性末端连接和平齐末端连接是最常用的,但不匹配的末端也可以经过修饰实现连接。
下面以质粒DNA为载体,介绍目的DNA片段与载体的连接。
黏性末端的连接涉及三种情况:①载体和DNA片段经双酶切后,两端具有不同的粘端,可以直接进行连接反应。②载体和DNA片段单酶切后,在DNA片段两端是互补的粘端。DNA片段插入载体时具有正反两个方向。③平齐末端连接需要在
DNA5'-端去磷酸化,否则线性载体DNA分子将发生自身环化连接。
(一)5'-端去磷酸化反应
通常只对载体DNA分子进行5'-端去磷酸化反应就基本可以避免自身环化连接。
【实验试剂与器材】
1.小牛肠磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)
2.10×CIP缓冲液
【实验方法与步骤】
1.酶切DNA反应,在75℃加热15min灭活酶活性;
2.10×CIP缓冲液和1U CIP,混合后,37℃孵育30~60min,然后75℃加热15min灭活CIP活性;
3.琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的DNA片段用于连接反应。
(二)连接反应
【实验试剂与器材】
1.T4 DNA连接酶
2.10×T4连接酶缓冲液
【实验方法与步骤】
反应体系:
质粒DNA (0.5(g/?滋l) 2?滋l
DNA插入片段(300ng/?滋l) 5?滋l
10× 连接缓冲液 1?滋l
T4 DNA连接酶 1?滋l
加水至总体积 10ul
混合后置14~16℃水浴6~12h。
【注意事项】
1)通常DNA插入片段与载体DNA的摩尔比为3:1或2:1,需根据DNA分子量计算,而不取决于浓度;2)平齐末端连接时,插入片段的量要远远大于载体DNA的量,可以为5:1或更多,即使这样,连接效率仍然很低。3)有时DNA
一端是粘端,另一端是平端,这种连接与双酶切粘端连接相似;4)不匹配末端需要连接时,首先要将末端处理成平端,然后再进行连接反应。