【注意事项】
基因组DNA分子量大，所有操作必须轻柔，酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用，应该戴手套操作。
二、RNA的制备
【实验目的】
1.理解生物细胞中RNA制备方法的原理。
2.熟悉组织细胞中RNA制备的基本操作。
（一）细胞总RNA的提取
1.异硫氰酸胍法
【实验原理】
异硫氰酸胍法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法，其基本原理是：异硫氰酸胍 (GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性，通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。
【实验对象】
新鲜哺乳动物组织或细胞
【实验试剂与器材】
（1）GuSCN缓冲液：
4 M异硫氰酸胍(GuSCN) ，25mmol/L 柠檬酸(pH7.0)，0.5% 十二烷基肌氨酸钠（SLS）。配制方法：先称取GuSCN加少量双蒸水溶解，然后加入其余成分，65℃加热使其充分溶解，4℃保存备用。
（2）GuSCN/25mmol/L β-巯基乙醇溶液：
将0.36ml β-巯基乙醇溶于200ml GuSCN缓冲中，4℃保存备用。
（3）2M NaAc (pH 4.0)
（4）0.1% DEPC-H2O：将0.1 ml DEPC加入100ml双蒸水中，室温摇晃12~24小时，然后15磅高压15min（注意：若用此水处理容器，可以不用高压处理）
（5）氯仿:异戊醇 (49:1, v/v)
（6）DEPC-H2O饱和酚：
将DEPC-H2O和酚1:1混合，室温摇晃1小时，然后静止使其分层，吸除水相，再加入DEPC-H2O重复一次，此即DEPC-H2O饱和酚。
（7） 无水乙醇
（8） 75%冰冷乙醇
【实验方法与步骤】
（1）取离心洗涤后的1×106培养细胞或相当量的研磨后的组织，加入200?滋 l GuSCN/25mM）-巯基乙醇溶液，剧烈震荡使细胞裂解，此时溶液变黏稠；
（2）加入下列成分：2M NaAc (pH4.0) 25?滋l，DEPC-H2O饱和酚240?滋l，氯仿:异戊醇 (49:1,v/v) 50?滋l，剧烈震荡10秒钟，冰浴15min；
（3）4℃，10,000×g离心30min，使其充分分层，水相应透明无任何混浊 [注：RNA在上 层水相，DNA和蛋白质在中间相和酚相中]；
（4）将上层水相转移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀 30min，4℃，10,000×g离心20min；
（5）弃上清，加入100?滋l GuSCN缓冲液将RNA沉淀溶解，然后加入200?滋l无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；
（6）弃上清，用75?滋l DEPC-H2O溶解RNA沉淀，加入7.5?滋l 2M NaAc (pH4.0)，165?滋l无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃，10,000×g离心20min；
（7）弃上清，加入75%乙醇(-20℃)1ml，不要混合，4℃，7500×g 离心10min；
（8）弃上清，室温自然干燥RNA沉淀 (注意：RNA沉淀不能过分干燥，否则将无法使其溶解)；
（9） 用DEPC-H2O溶解RNA备用。若长期保存，应将RNA悬于75%乙醇中置-20℃。
【注意事项】
1.所有试剂均用DEPC-H2O配制；操作中要防止RNA酶的污染，必须戴手套，戴口罩，玻璃器皿可在烤箱中180℃烘烤2h，灭活RNA酶，或者用新的。
2.Trizol试剂法：原理、试剂、器材.
用Trizol试剂(美国Gibco公司产品)在室温下可提取RNA、DNA及蛋白质，具有快速方便、提取量大等优点。
【实验方法与步骤】
（1）0.5~1×107 细胞或相当量的组织，用1ml Trizol试剂裂解细胞，摇动混合后室温孵育5~10min；
（2）加入2氯仿，震荡混匀15秒，置室温2～3min；
（3）10,000×g，4℃离心15min，将水相移至另一离心管中，加入 0.5ml异丙醇，混合后室温沉淀10min，10000×g离心10min；
（4）弃上清，加入1ml 75%乙醇，不混合，7500×g离心10min；
（5）弃上清，室温下空气蒸发残存的乙醇。
3.Oligo(dT)纤维素层析法提取mRNA
【实验原理】
真核细胞的3’端有poly(A)尾，因此可用Oligo(dT)纤维素结合 mRNA，从而将mRNA从总RNA中分离出来。Oligo(dT)纤维素就是将Oligo(dT)15～18结合到纤维素上，制备成能特异性结合带 Poly(A)尾RNA的纤维素。
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