酶切、回收、连接 常识（6）

二．多选题

1．重组连接时，反应体系必须的组分有（ A、C）

A．Mg²⁺   B. BSA   C. ATP   D. PO₄^3-  E . EDTA

2．DNA片段重组连接可用下列哪些方法（A、B、C、D、E）

A．平末端连接    B. 粘末端连接  C. 加接头连接    D.  同聚尾连接

E . T载体连接

3．酚抽提法回收DNA片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应（A、C）

A．酚  B.微量的EB  C.琼脂糖   D. 少量的乙酸钠   E .少量的乙醇

4．产生平末端的方法主要有（A、B、E）

A．用产生平末端的限制酶切 。

B．用klenow片段补齐5‘粘末端。

C．用末端转移酶补齐粘末端。

D．用Taq聚合酶补齐粘末端。

E．用S1核酸酶降解粘末端。

5．在DNA重组连接时，常采用连接头连接（linker ligation），其作用是（A、B、C、E）

A．引入某些限制酶切位点。        B.  人工构建载体。

C．增加调控元件。                D.  调整阅读框。

E．通过接头引入与目的基因相同的限制酶位点，并对目的基因相应酶切点进行甲基化修饰保护，可保护目的基因不受限制酶破坏。

6．构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于（A、B、C、D）

A．避免载体自身环化   B.  提高连接效率   C.  控制外源基因的插入方向

D.  便于转化后的筛选     E . 便于修改阅读框

7．下列关于同聚物加尾法的说法正确的是（A、B、C、D、E）

A．其核心是利用末端转移酶的功能，将载体和外源DNA的3‘端再加上一端寡核苷酸。

B．不易自身环化。  C. 连接效率高       D.  适用于CDNA克隆

E．可能会产生某种限制酶切位点。

8．下列与DNA重组连接相关的说法正确的是 （A、D、E）

A．不匹配的粘末端可通过部分填补后连接。

B． 同聚尾法连接不仅连接效率高，也易回收插入的片段。

C．限制酶切割DNA后加入EDTA-SDS终止液抑制限制酶活性，将有利于重组连接。

D．Mg²⁺-ATP是T₄DNA连接酶反应时的必须因素。

E．平末端连接时，在反应体系中加入适量凝聚剂可提高连接效率。

9．下列哪些因素对保证较高连接效率是有利的（A、C、D）

A．高纯度DNA。

B．载体与目的基因摩尔数之比为1：1。

C．载体与目的基因摩尔数之比为1：3~5。

D．连接反应体系中DNA浓度较高。

E．连接反应体系中DNA浓度较低。

10．如果DNA分子重组时，需要用平端连接，下列哪些方法可形成平末端（B、C、D、E）。

A．3‘突出的粘末端用DNA聚合酶加dNTPs填平。

B．3‘突出的粘末端用核酸酶切平。

C．5‘突出的粘末端用DNA聚合酶 加dNTPs填平。

D．5‘突出的粘末端用核酸酶切平。

E．利用切口为平末端的限制酶。

三、填空题

1．形成平末端的方法有 用产生平末端的限制酶切，用S1核酸酶切除粘末端 ，用DNA聚合酶填平粘末端。

2．载体与CDNA连接重组可用的方法有 同聚尾连接酶，加人工接头连接法。

3．DNA片段重组连接时，如要克隆PCR产物，PCR产物可直接用 T载体连接，而无须用限制酶处理。

4．回收DNA片段时，在确定DNA条带位置时，应使用 长 波长紫外灯，以最大限度减少对DNA的照射损伤。

5．回收DNA片段时，常用 正丁醇 处理以除去EB。

6．在用单一限制酶切载体和目的基因并进行连接时，为防止载体自身环化，常用碱性磷酸酶 处理载体，或用 α-互补 进行筛选。

7．DNA片段重组连接的方法主要有 平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接 。

四．简答题

1．如何将一平末端的DNA片段与BamH I形成的粘末端连接？

答：使用加接头连接法。人工合成一段含BamH I酶切位点的DNA短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用BamH I切割连接片段，即可形成BamH I的粘末端。