[实验原理]
限制性内切酶识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently
closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，(open circular
DNA，简称OCDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA，简称L
DNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂]
（一）仪器与材料
恒温水浴槽、电泳仪、电泳槽、紫外线透射仪、移液枪、质粒、HindIII酶、EcoRI酶
(二) 试剂
1 000 mL 5xTBE：Tris 54 g硼酸27.5 g 0.5 mol／L EDTA 20 mL（pH 8.0）
凝胶加样缓冲液(6x)：溴酚蓝0.25％蔗糖40％
琼脂糖 溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL
[实验步骤]
(一) 酶切
取5uLDNA溶液，加1uL酶切缓冲液，EcoRI酶1uL(2U)，无菌水补至总体积10uL，37保温3h，加凝胶上样缓冲液(6X)2uL，准备下个实验进行电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。
(二) 琼脂糖凝胶电泳检测
1、 制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度／％线性DNA的有效分离范围／kb
0.3 5—60
0.6 1—20
0.7 0.8—10
0.9 0.5—7
1.2 0.4—6
1.5 0.2—4
2.0 0.1—3
称取0．3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL1xTBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。
2、 胶板的制备
将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子；将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；待胶凝固后，取出梳子，并放在电泳槽内，加人电泳缓冲液至电泳槽中。
3、加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
4、电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V／cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。
5、染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色(15min)以观察在琼脂糖凝胶中的带(戴手套操作)。
[实验结果]
在紫外灯(360nm，312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。
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