实验概要
掌握ELISA样品制备的基本方法。
主要试剂
1. 细胞/组织提取缓冲液配方
1) 100 mM Tris, pH 7.4
2) 150 mM NaCl
3) 1 mM EGTA
4) 1 mM EDTA
5) 1% Triton X-100
6) 0.5% 脱氧胆酸钠
2. 制备完全提取缓冲液所需的其它试剂
1) 磷酸酶抑制剂混合物
2) 蛋白酶抑制剂混合物
3) PMSF
注意：使用前，用如制造商所述的磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物以及 PMSF 将细胞提取缓冲液补充至 1mM。
实验步骤
1. 细胞培养物上清液
将细胞培养基移至离心管，并在 4℃下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
2. 细胞提取物
1) 将组织培养板放置在冰上
2) 吸出培养基并且用冰冷的 PBS 轻轻洗涤细胞一次
3) 吸出 PBS 并且每 100 mm 培养板添加 0.5 ml 完全提取缓冲液
4) 剥离细胞，收集在倾斜板中，然后移至预冷管中
5) 短暂涡旋并在冰上孵育 15-30 分钟
6) 在 4℃下以 13,000 x rpm 离心 10 分钟，沉淀不溶性内容物
7) 将上清液（这里是指可溶性细胞提取物）等分至冰上干净的冷却管，然后在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
3. 条件培养基
将细胞接种到完全（含血清）生长培养基中，使细胞增殖到所需汇合度。弃去生长培养基并用几毫升温热 PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。弃去最后的 PBS 洗涤液并小心添加无血清生长培养基。孵育 1-2 天。将培养基移取至离心管，并在 4℃下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
4. 奶乳
收集样品并在 4℃下以 10,000xg 离心 2 分钟。等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
5. 血浆
将全血收集到含抗凝血剂的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目录号：363080/363080）或添加 0.1M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。在 4℃下以 3000 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液（血浆）并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
6. 尿液
收集样品并在 4℃下以 10,000xg 离心 2 分钟。等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
7. 唾液
收集样品并在 4℃下以 10,000xg 离心 2 分钟。等分上清液并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
8. 血清
将全血收集到未经处理的测试管中，或者如不含抗凝血剂的管，例如 BD 血清用真空采血管（目录号：367812）。在室温下不受干扰地孵育 20 分钟。在 4℃下以 3,000 rpm 离心 10 分钟。立即等分上清液（血清）并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
9. 组织提取物
1) 用干净的工具切割所关注的组织，最好在冰上进行，并应尽可能快以防止被蛋白酶降解。
2) 将组织置于圆底的微量离心管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80℃下以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。
3) 对于约 5 mg 的一片组织，需要向管中添加约 300 µl 完全提取缓冲液（查看细胞/组织提取缓冲液配方），然后用电动匀浆器匀浆。
4) 清洗刀片两次，每次清洗使用 300µl 完全提取缓冲液，然后在 4℃下维持恒定搅拌 2 小时（例如置于冷室中的回旋振荡器上）。
5) 在 4℃下以 13000 x rpm 离心 20 分钟。置于冰上，将上清液（这里是指可溶的蛋白质提取物）等分至新的冷却管中并在 -80℃下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
注意：裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。最终蛋白质提取物的典型浓度 > 1 mg/ml。
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