3、在线稀释技术的应用 3 —— 双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS
大体积进样量有可能会带来一个问题，即基质杂质增加，影响定量准确度。固相萃取SPE是一种有效的样品富集和除杂手段，广泛应用于食品、环境或生物样品的前处理。但手工操作的离线SPE存在操作繁琐复杂、耗时、重现性差等缺点，而在线SPE-HPLC可以部分解决以上问题。
目前的在线SPE-HPLC系统一般分为两步进行，第一步是富集+除杂质，第二步是解吸+分离。见图5所示。该系统通常由两个流路连接一个六通阀组成，萃取柱连接在六通阀上。第一个流路(虚线部分)是提取和富集，另一个流路(实线部分)是样品的解吸和高效液相色谱分离。分析开始时，样品由自动进样器导入，随后被液相泵推动通过SPE柱完成目标物的富集(弱保留杂质流经SPE柱而无保留)。然后切换阀门，SPE柱被切换到两个色谱泵和色谱柱之间，流动相A和B兼任解吸液，将目标物从SPE柱上解析下来并随后进入色谱柱进行分离分析。
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图5.在线SPE系统常见的配置和流路构造 |
然而，这个系统有几个缺点：首先解吸分离步骤中，SPE柱连在两个泵和色谱柱之间，这意味着只能耐受常压的SPE柱要承受和高效液相色谱柱相同的压力；其次，如果使用与这个SPE柱相匹配的常规色谱柱，通常直径为4.6mm，最优流量为1mL/min，超出了ESI源离子化承载的流量，因此需要通过降低流速或柱后分流等手段减少ESI负荷，最终导致方法灵敏度下降；第三，流动相A和B兼任解吸液和分离溶液，在大多数情况下，最佳解吸溶液与最佳流动相不是同种溶液，最终导致解吸效率下降或峰展宽；最后，样品为生物样品或高比例强溶剂萃取液时，在进样前需要用弱溶剂离线稀释，虽然离线稀释即耗时又间接减小了进样浓度，但非常有必要：一是将目标化合物与基质脱附(如药物与蛋白质的脱附)；二，将高比例强溶剂稀释为高比例弱溶剂，以提高过柱过程中在萃取柱上的保留。
为解决以上缺点，岛津设计了双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统，其配置和流路设计见图6。
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| 图6. 双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统的硬件配置和流路设计；ZL号CN103940941B |
这个系统有三个分析步骤：
(1)第一步是样品的稀释和提取。样品通过自动进样器直接注入系统，通过泵D稀释溶剂推送进入高效混合器1，样品被在线稀释为弱溶剂。然后稀释液加载到固相萃取柱完成目标物的富集及杂质的去除。
(2)当富集除杂完成后，切换阀1，进行目标物的解吸和捕获。在这一步中，泵C推送最优的解吸液到固相萃取柱，目标物被解吸液解吸并移动经过500μL定量环，调整分析方法至绝大部分目标物捕集到定量环1中，切换定量阀进入第三步。
(3)第三步是解吸液的柱前稀释，以及进行超高压的样品分离分析。柱前稀释的原理即为此前提到在线稀释，可即时将解吸液稀释为90%以上的弱溶剂，然后才进入超高压液相色谱柱。此时弱溶剂完全没有洗脱能力，因此目标物将在色谱柱头进行聚焦。之后改变有机相比例，实现梯度洗脱，得到尖锐的色谱峰形。在此过程中实现了解吸液的柱前稀释、超高压的色谱分离。此时超高压色谱柱使用的是最优流速，且无需分流，与质谱完美匹配，提高分析的灵敏度。
该在线系统相对于普通SPE-HPLC系统有以下优点：
(1)实现萃取前样品的在线稀释，免除离线稀释的手工误差；
(2)破除分离色谱柱的局限性，可以使用UHPLC高压柱，分离条件与SPE萃取条件相互独立，与ESI质谱相匹配；
(3)独立解吸泵推送解吸液：可以使用最优解吸条件，并具有解吸效率最高，解吸时间最短，解析液体积最小等优点；
(4)解吸溶剂的截获&切换：在解吸条件最优的条件下，使用500 μL定量环(可随SPE尺寸调整)，确保解析液全部被截获；定量环还起到压力过度作用，SPE柱不与UHPCL柱串联，全程处于低压状态；
(5)大体积解吸溶液的在线稀释，实现柱头聚焦和有效UHPLC分离。
我们用这个系统先后应用于植物提取液中三种植物激素和血浆样品中十种抗精神病药的直接检测，得到了满意的结果：
(1)双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于植物提取液中植物激素的直接检测
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| 图7. 双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于植物提取液中三种植物激素的直接检测； Qisheng Zhong, et al. Journal of Chromatography A, 2014. 1359: 131-139. |
(2)双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于血浆中十种抗精神病药的直接检测
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图8.双步稀释SPE-UHPLC-MS/MS在线分析系统用于血清中十种抗精神病药的直接检测； |
由以上应用实例我们可以看到，使用岛津独有的在线稀释技术，可以大大提高超液相色谱的饭量，不但能提高灵敏度，而且能够应用在在线分析系统，实现目标物的富集和杂质去除，得到满意的分析结果。
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