在《 Hello~自噬 》一文中，我们曾给大家介绍过自噬。自噬在维持稳态和多种疾病中都起着重要作用。那么在实验中，如何检测自噬呢？
自噬，简单来说就是细胞自己吃自己、废物再利用。细胞陷于困境时 (如营养物质匮乏)，启动自噬程序自救，通过降解蛋白质和细胞器获得必需的氨基酸、脂肪酸等营养物质维持基本生命活动，以便死中求生。一直以来， 自噬都是生命科学领域的研究热点。
2020 年 8 月 17 日，图卢兹大学综合生物研究中心 Arnaud Besson 教授团队，在期刊 Nature cell biology 中发表的自噬相关文章 (图 1) ，阐明了自噬与细胞周期调控的新机制。
图 1. p27 调控自噬-溶酶体途径，协调细胞周期和生长
背景介绍
p27 Kip1 (p27) 被认为是细胞周期蛋白 CDK 的抑制因子，具有诱导细胞周期停滞的能力。营养匮乏往往是自噬发生的主要诱导原因，已有研究表明，细胞质中的 p27 是自噬的正调节剂 (葡萄糖匮乏或者血清剥夺的条件下) ，它可以保护细胞免受应激诱导的细胞凋亡。但是，p27 调控自噬作用的具体分子机制仍然是未知的。
p27 调控细胞自噬
作者团队通过研究 p27+/+ MEFs 和 p27-/- MEFs 应对氨基酸剥夺后自噬的变化，证明了氨基酸缺乏的细胞中，p27 促进自噬。
细胞：
p27+/+ MEFs: p27 野生型 (p27+/+) 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs)，源于 p27 野生型小鼠胚胎。
p27 +/+ MEFs: p27 缺失型 (p27 -/- ) MEFs，源于 p27 缺失的小鼠胚胎。
1、p27 促进自噬发生
LC3B-II 是自噬小体的标记物，位于自噬体膜，与溶酶体融合时被降解。氨基酸剥夺的短时间内，如图 2a 所示，p27 +/+ 和 p27 -/- 小鼠胚胎成纤维细胞中，LC3B-II 表达水平相似，随着氨基酸剥夺时间的延长，p27 -/- 中的 LC3B-II 表达水平明显会更高，并且在 48 小时表现出显著统计学差异 (图 2b) 。在随后的实验中，选择 48 小时作为氨基酸的长时间剥夺的诱导时间。图 2c 的 LC3B 的免疫荧光染色同样也呼应这一观察结果 (红色箭头) 。这表明 p27 可促进氨基酸剥夺细胞中的自噬。
图 2. 氨基酸剥夺不同时间，细胞中 LC3B，LC3B-I 和 LC3B-II 的表达
【a-b: 指定时间段内氨基酸缺失的 p27 +/+ 和 p27 -/- MEFs 的 LC3B-I 和 LC3B-II 的表达和定量分析；c-d: p27 +/+ 和 p27 -/- MEFs 在 0 h 和氨基酸剥夺 48 h 后 LC3B（绿色荧光）免疫荧光染色和定量分析】
2、p27 调控自噬流的检测
自噬是一个多步骤的动态过程，当应答营养匮乏的压力时 (如氨基酸或葡萄糖缺乏)，细胞接受自噬诱导信号，随后会在胞浆处形成一种扁平的叫做吞噬泡 (Phagophore) 的双层膜结构。紧接着，吞噬泡不断延伸，包裹一些细胞元件或者自噬物 (Autophagic cargo)，形成密闭的球状的自噬小体 (Autophagosome)。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体 (Autolysosome)，自噬体中的内容物被溶酶体中的酶降解，降解产生的营养物质会被细胞重新利用。
在整个过程中，细胞将自噬物吞噬到自噬小体，直到最后自噬溶酶体形成并降解自噬物的这个过程被称为自噬流 (Autophagic flux) (图 3)。自噬流中的任一环节出现障碍自噬都无法完成其生物学功能。
图 3. 细胞应答营养匮乏压力时，自噬发生的示意图[2]
【吞噬泡 (Phagophore)-自噬小体 (Autophagosome)-自噬溶酶体 (Autolysosome)】
上文已经说到 LC3B-II 通常是自噬小体的 Marker，哺乳动物细胞内 LC3B 的总量通常不会有巨大波动，一般只会出现 LC3B-I 和 LC3B-II 间的相互转换。
如果 LC3B-II 表达增加，可能是由于前期自噬活化后自噬小体增多导致的，也可能是后期自噬溶酶体清除失败使其积累所致。因此，某单一时间点的 LC3B-II 的表达改变并不能体现自噬流的改变。
在文章中，使用了 WB 检测蛋白、免疫荧光，mCherry-eGFP-LC3B 双荧光系统的组合测量方法，检测 p27+/+ 和 p27-/- MEFs 自噬流。
首页
