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关于细胞自噬的观察检测的介绍

2022.3.21
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coco5517

认真做好每一件喜欢的事,把每一件要做的事都变成喜欢并认真去做的事

  细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:

  1、观察自噬体的形成

  由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV)

  2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

  由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。

  3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成

  自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

  (注意:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)

  4、检测长寿蛋白的批量降解:非特异

  5、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。

  6、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。

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