人肺脏类器官培养在探究新冠病毒感染肺的机制的应用

2021.3.08

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

引言

众所周知，新冠病毒是会引起肺部损伤的。为助力您探究其感染机制，PeproTech在此为您提供一份全面的人肺脏类器官培养方案。
肺类器官由ESCs/iPSC分化而来，hESCs体外肺分化实际上是通过加入多种细胞因子和小分子化合物模拟体内肺发育各阶段的过程，hESCs体外肺分化主要经历以下几个阶段：

首先hESCs在活化素A(Activin A)的作用下分化为定型内胚层阶段(definitive endoderm, DE)。
随后再加入细胞因子和小分子化合物使DE阶段的细胞进一步分化为前部前肠内胚层（anterior foregut endoderm， AFE）阶段。
接着形成前肠球体，最终在3D培养环境中分化为肺类器官。

▶▶ 实验材料◀◀

1. Matrigel人胚胎干细胞培养用基质胶,于冰上分装后保存于-80℃。(Corning,Cat#354277)

2.Advanced DMEM/F12培养基。(Thermo, Cat#12634010)

3. Matrigel类器官培养用基质胶，于冰上分装后保存于-80℃(Corning,Cat#356231)

4.Knock Out Serum Replacement, 分装后保存于-20℃。(Thermo,Cat#A3181502)

5.B-27 trademark Supplement(50X), 分装后保存于-20℃(Thermo,Cat#17504044)

6.N-2 Supplement(100X),分装后保存于-20℃。(Thermo,Cat#17502001)

7.HyClone-defined FBS ，分装后保存于-20℃。(Thermo Fisher Scientific,Cat#10437010)

8.mTeSR™1(Stemcell Technologies, Cat#85850)

9.Activin A配制为100μg/ml, 保存于-80℃，使用终浓度为100ng/ml。(PeproTech,Cat#120-14)

10.Noggin配制为200μg/ml,保存于-80℃，使用终浓度为200ng/ml。(PeproTech,Cat#120-10C)

11.FGF4配制为500μg/ml,保存于-80℃，使用终浓度为500ng/ml。(PeproTech,Cat#100-31)

12.FGF10配制为500μg/ml,保存于-80℃,使用终浓度为500ng/ml。(PeproTech,Cat#100-26)

13.Y-27632配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM。(BioGems, Cat#1293823)

14.SB431542配制为10mM, 保存于-80℃，使用终浓度为10μM。(BioGems, Cat#3014193)

15.CHIR99021配制为2mM, 保存于-80℃，使用终浓度为2μM。(BioGems, Cat#2520691)

16.SAG配制为1mM, 保存于-80℃，使用终浓度为1μM。(BioGems, Cat#9128694)

17.Accutase消化液(Thermo,Cat#A1110501)

▶▶ ESCs/iPSC培养传代步骤◀◀

01/ hESCs的复苏

预先将Matrigel(Cat#354277)从-80℃取出，置于冰上融化，随后用预冷的DMEM/F1培养基稀释100倍，取1ml加入六孔板的一个孔，晃匀至铺满孔板底部。六孔板置于37℃培养箱中至少30min，备用。mTesR1人胚胎干细胞培养基提前从4℃冰箱取出，室温放置约10min。从液氮冻存盒中取出H9细胞(hESC细胞系)，快速移入37℃水浴锅中融化，轻柔晃动至冻存管还剩小块冰即取出，小心将细胞转入15ml离心管，加入５ml mTesR1培养基轻轻混匀细胞，1000rmp/5min离心，小心弃去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培养基重悬细胞，细胞接种于基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中培养。次日加入DMEM/F12培养基轻柔洗一次，更换新鲜不含Y-27632的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。

02/ hESCs的培养

每天更换新鲜mTesR1培养基前应观察细胞状态，若发现大量死细胞漂浮于培养基(刚复苏的细胞状态较差)，则弃去培养基，加入预热的DMEM/F12培养基轻柔洗细胞一次，弃去DMEM/F12培养基，加入新鲜mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养。

03/ hESCs的传代

细胞约3~5天生长至80%汇合度，状态良好的hESCs克隆明显，边缘光滑。细胞传代时根据实验需要提前用Matrigel包被培养板，细胞用DMEM/F12培养基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培养箱中消化3~5min，传代比例为1:5~1:10。每隔2min在倒置显微镜下观察细胞，待克隆边缘发亮即小心弃去消化液，加入2ml含10μM的Y-27632的mTesR1培养基轻柔吹打细胞数次，收集细胞于15ml离心管，1000rmp/5min离心，小心弃去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培养基重悬细胞，转入基质胶包被的培养板，置于37℃培养箱中继续培养。过夜后更换新鲜的不含Y-27632的mTesR1培养基，置于37℃培养箱中继续培养，每天换液。

04/ hESCs的冻存

冻存液为含5~10％二甲基亚砜(DMSO)的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ备用。按照前述细胞传代的方法收集细胞，用细胞冻存液轻柔重悬细胞，转入冻存管，做好标记，置于冻存盒，-80℃过夜后转入液氮中长期保存。

▶▶ 肺类器官的培养分化◀◀

01/

取对数生长的hESCs肺类器官分化，hESCs(生长至约90％汇合)用预热RPMI1640基础培养基轻柔洗２次，加入含100ng/ml的ActivinA和2μM的CHIR99021的定型内胚层(DE)阶段诱导培养基(诱导第二天培养基内需要添加0.2%FBS, 诱导第三、四天培养基内需要添加2%FBS)，每天换液，共4天。

02/

第４天，细胞用Advanced DMEM/F12培养基轻柔洗2次，在DMEM/F12培养基种加入1xB27, 1xN-2以及含200ng/ml的Noggin，500ng/ml的FGF4，2μM的CHIR99021，1μM的SAG和10μM的SB431542的前部前肠内胚层(AFE)阶段诱导培养基，每天换液，共5天。

03/

第9天，待细胞分化成前肠球体后，细胞用Advanced DMEM/F12培养基轻柔洗２次，加入适量Accutase消化液消化3~5min，收集细胞，1000rmp/5min离心,弃上清，加入适量预冷Matrigel(Cat#356231)，吹打混匀，注意不要产生气泡，加入50ul种于24孔板内，37℃培养箱放置约30min，待Matrigel固化后加入肺类器官培养基(含1％FBS的 Advanced DMEM/F12培养基，1xB27, 1xN-2，500ng/ml FGF10)同时需要补加10μM的Y-27632。过夜后更换新鲜的含肺类器官培养基。细胞每3~5天换液一次，每５~８天传代一次，传代时需要加入含10μM的Y-27632肺类器官培养基。大约培养50天肺类器官可以成熟。