使用基于ATF的补料分批/灌流混合工艺进行病毒疫苗生产
来自德国马克斯·普朗克复杂技术系统动力学研究所和ProBioGen AG等的科学家们在2019年第103期的《Applied
Microbiology and Biotechnology》杂志上发表了题为“High titer MVA and influenza A
virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF
system”的文章。文中，研究人员提出了一种在高细胞密度工艺中提高MVA（修饰的安卡拉痘苗病毒）产率的培养策略。该策略基于此前研究人员在摇瓶培养中开发的方法，在台式生物反应器中建立，包括AGE1.CR.plX细胞在化学限定培养基中悬浮培养至高细胞密度，然后以MVA-CR19病毒株感染。首先，建立灌流策略，以优化细胞生长阶段。其次，初始感染阶段选择补料分批策略，以促进病毒摄入和细胞间的传播。最后，再切换为灌流，为病毒增殖晚期连续提供营养物。该补料分批/灌流混合策略获得最大感染性滴度为1.0
x 10^10
IU/mL，相比传统批次培养，产物滴度可提高一个数量级。最后，从生产灭活疫苗考虑，将该策略用于生产流感A/PR/8/3（H1N1）病毒，使用相同的培养系统，可达到3.8
× 10^10 virions/mL的总数。总体来讲，使用相同的系统，可获得与传统批次培养相当或更高的细胞特异性病毒产量和单位体积产率。此外，大多数病毒颗粒在培养上清中，可简化下游操作，特别是MVA病毒。研究人员总结认为该策略有助于新的病毒疫苗生产方法的开发。
实验：生物反应器培养
CR.pIX细胞以0.8-10^6cells/mL的密度接种1L 台式生物反应器，工作体积0.6-0.8L。生物反应器操作条件设置为37℃、pH
7.2、搅拌速度
120-160rpm，以20μm微泡控制DO为40%。细胞开始以批次模式培养，当葡萄糖浓度达到14-17mM时（接种后60-72h），开始灌流。灌流使用XCell ATF 2系统，以C24控制器控制，流速设置为1.0L/min，并以确定的灌流速率进行操作，以达到＞25 x 10^6cells/mL的细胞密度。
在细胞生长阶段，灌流速率每12或24h手动调节。操作时，离线检测活细胞密度，计算取样时间点的相应流速，确保CSPR为0.06nL/cell/day，这是CR.pIX细胞基于其葡萄糖消耗速率的最佳置换速率。根据最高细胞特异性生长速率μ=0.026h-1，计算12或24h后的预期活细胞密度和相应的灌流速率。使用BIOSTAT
B plus模块的级联控制，可获得采样时间点之间的线性曲线。感染前2h，使用ATF系统，以新鲜培养基置换1个反应器体积。
培养置换后，生物反应器感染MVA-C19或流感A病毒A/PR/8/34（H1N1）。对于MVA-CR19病毒，使用2种补液程序加上灌流程序，命名为混合工艺1和混合工艺2，以优化在高细胞密度条件下的病毒增殖。对于混合工艺1，废弃部分细胞悬液，以0.3L的细胞悬液开始病毒生产阶段。病毒感染后，加入0.15L新鲜培养基，立即开始补料分批，在感染后12h再补液0.15L，感染后24小时，补液0.3L。最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率进行灌流。病毒颗粒（200-400
nm）使用与细胞生长阶段相同的ATF中空纤维组件进行收获。相似的，对于混合工艺2，在病毒感染后立即补液0.2L，之后在感染后24h，补液0.25L，最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率进行灌流。为提高病毒收获，在感染后36小时，将细胞生长阶段使用的0.2μm中空纤维组件替换为新的更大孔径组件。对于流感病毒A生产，评估了一种与MVA-CR19病毒相似的混合策略。
详细内容，请参考原文。
原文：D.Vazquez-Ramirez, I.Jordan, V.Sandig, High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103: 3025-3035.
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