1.5 标准品的制备
标准品包括：阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品。以结核杆菌阳性DNA样品2μl做为PCR反应的模板，加入PCR反应液23μl，PCR反应液中含有10x PCR Buffer 3μl、25mmol/L MgCl2 1.2μl、10mmol/L dNTPs 3μl、4U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl及10pmol/L上、下游引物各1μl，灭菌双蒸水13.3μl。于PT-200 PCR扩增仪进行如下循环：先94℃预变性4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒回收PCR电泳产物，与线性化后的pMD18-T载体（Invitrogen公司）4℃下连接12～16h，连接反应体系中含有PCR凝胶回收产物3μl、连接缓冲液5μl、线性化后的pMD18-T载体1μl和T4连接酶1μl，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的1.5％琼脂固体LB培养基上，37℃倒置培养12～16h，用灭菌牙签挑取单克隆，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的5ml液体LB培养基中，200rpm摇床37℃震摇过夜；取1.6ml过夜培养物，抽提质粒，经PCR初步鉴定，对阳性克隆进行测序分析，将筛选出的阳性菌株进一步扩增，抽提质粒DNA，用核酸蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定4次，每次重复4管，取均值)，并进行10倍系列稀释，得到浓度分别为108、107、106、105copies／ml的4个标准品，即为阳性定量参考品。阴性质控品以生理盐水制备，强阳性质控品和临界阳性质控品根据浓度和拷贝数以标准品经灭菌水稀释后制得。
1.6 Taq-man探针实时PCR及反应条件
反应液总体系为20μl，每份反应液中含有2×Probe－PCR Master Mix 10μl，上、下游引物(10μmol/μl)各0.5μl，探针(10μmol/μl)0.2μl，灭菌水6.8μl，结核杆菌阳性DNA样品2μl。反应条件为: 95℃ 15min(×1) ，94℃ 10s→60℃ 20s →72℃ 30s(×40)。按照上述反应体系及反应条件，随着PCR体系在每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。
1.7 琼脂糖凝胶电泳，测序
实时PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳，电压100V，时间1h。ABI3130基因分析仪序列分析。
1.8 特异性实验
分别用阴性痰标本提取物25份和金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA提取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物共20份为对照模板进行Taq-man探针进行实时PCR检测。
1.9 检测限实验
对阳性样本以10倍梯度进行稀释，共5个稀释度，最大稀释倍数为10万倍，然后以各稀释液为模板进行实时PCR检测。
1.10 重复性实验
对107标准品重复测定4组10倍倍比稀释阳性DNA 五次,分别统计其Ct 值。
1.11 灵敏度实验
对102例痰液标本分别进行抗酸染色显微镜检测和实时PCR检测。
2、结果
2.1 定量曲线
各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值，接下来一直到第20个循环结束时都没有明显变化。从第23个循环开始其中的一个反应的吸光值增大，定量曲线开始抬头，25个循环(Ct 值) 后，曲线迅速上扬，至第36个循环前后达到峰值，随后进入平台期，一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线。
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