阴道加德纳菌四种临床检测方法的比较

　一、材料和方法

　　1.临床标本：50份宫颈分泌物，取自西京医院门诊妇产科就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中。

　　2.革兰染色法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，常规革兰染色，找到线索细胞者为阳性。

　　3.吖啶橙染色荧光法^［1］：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，自然干燥，火焰固定，0.1 mmol/L吖啶橙染色37℃30 min，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，0.01 mmol/L 氯化钙分色1 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗1次，甘油封片，荧光观察结果。在上皮细胞中发现成堆桔黄色细小杆菌为阳性。

　　4.分离培养鉴定法^［2］：将无菌生理盐水中的阴道或宫颈分泌物，以无菌手续接种于阴道加德纳菌专用分离培养基上，置5％二氧化碳培养箱37℃孵育48 h，挑取灰色、半透明、光滑、露滴状样菌落，如为革兰染色阴性小杆菌者，进行鉴定，生化鉴定标准按文献［3］进行鉴定。

　　5.PCR检测法：(1)根据Belkum等^［4］报道加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区为特异性引物序列，扩增片段：433bp。引物15′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′引物2 5′-TACA-AGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成。(2)临床标本模板DNA的制备：将宫颈分泌物500μl生理盐水中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加碱性裂解液，98℃10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液做模板。(3)PCR扩增和产物检测：反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP 1.5 μl，引物1，2各0.25 μl，无菌去离子水9.5μl，模板10 μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30 μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，最后72℃延伸5 min。取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min，于紫外光下观察结果，出现433 bp扩增带者为阳性，未见433 bp扩增带为阴性。

　　二、结果

　　将50份宫颈分泌物标本，用革兰染色、吖啶橙染色、分离培养，PCR检测同时对加德纳菌进行检测，其中，革兰染色9份为阳性，阳性检出率为18.0%；吖啶橙染色10份为阳性，阳性检出率为20.0%分离培养有8份为阳性，阳性检出率为16.0%；PCR有14份为阳性，阳性率为28.0％。在14份PCR检测阳性的标本中，同时有9份被革兰染色，8份被分离培养所证实，对6份PCR检测阳性而分离培养阴性的患者，经临床调查为取标本前曾用抗生素治疗的患者。

　　三、讨论

　　目前革兰染色找线索细胞仍是一种诊断性阴道病的常规方法。吖啶橙染色荧光检测法是近年来一种新的较为理想的检测手段^［5，6］，由于吖啶橙是一种具有异染性染料，吖啶橙以插入方式与病原体双螺旋DNA分子结合，根据病原体DNA或RNA对吖啶橙染料的吸附方式不同所放射的荧光也不同，再加上加德纳菌在侵袭的靶目标为上皮细胞聚集，当吖啶橙染色后在荧光照射下，发射出桔红色荧光，能清晰地检测出加德纳菌在上皮细胞上的聚集现象，作出精确的诊断。分离培养鉴定法是国际确认的金指标，临床上由于不正规的应用抗生素，导致许多病原体在一定程度上受到抑制，给分离培养带来困难，造成分离培养阴性结果，建议做分离培养应取材于治疗前的标本，需要专用的高营养的培养基，以提高分离培养的阳性检出率。PCR技术具有高度的特异性和敏感性，选用特异的寡核苷酸引物序列，检测目的是病原体的遗传物质DNA不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义。

作者单位：苏明权（710032西安，第四军医大学西京医院检验科)

　　于文彬（710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)

　　马越云（710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)

　　张建芳（710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)

　　丁振若（710032 西安，第四军医大学西京医院检验科)

　　陈必良（710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科)

　　王德堂（710032 西安，第四军医大学西京医院妇产科）