【摘要】 目的：探讨我院临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的β-内酰胺酶相关基因及Ⅰ类整合子(intⅠ1和qacE△1-sul1)的携带情况，为临床抗感染治疗和控制医院感染提供依据。方法：采用K-B法对临床分离的铜绿假单胞菌进行药敏试验，选出34株多重耐药菌株，用PCR法检测其相关耐药基因16种。结果：在34株多重耐药铜绿假单胞菌中共有13种耐药基因阳性，阳性率较高的为qacE△1-sul1、oprD2缺失、blaTEM。结论：多重耐药铜绿假单胞菌可同时获得多种耐药基因，临床应根据药敏结果选择用药，以减少耐药菌株的产生，控制院内感染。
【关键词】 铜绿假单胞菌;耐药基因;β-内酰胺酶;Ⅰ类整合子
[ABSTRACT] Objective： To explore the resistance gene and prevalence of beta-lactamas and classⅠintegron of clinical isolates of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRPA) in our hospital， and provide evidence for clinical anti-infective therapy and control the nosocomial infection. Methods： Antimicrobial susceptibilities of the Pseudomonas aeruginosa isolates were detected by Kirby Bauer method. Out of 34 collected MDRPA strains， 16 kinds of resistance genes were detected by polymerase chain reaction (PCR) method. Results： Thirteen kinds of resistant genes were detected as positive for the 34 strains. Relevant higher positive rates were observed for qacE△1-sul1、oprD2 defect and blaTEM. Conclusions： Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa have several kinds of resistant genes. Antibiotics should be used rationally according to antimicrobial susceptibility in order to control the development of multidrug bacteria and nosocomial infection.
[KEY WORDS] Pseudomonas aeruginosa;Resistant gene ;Beta-lactamase ; Class1integron
铜绿假单胞菌(PA)是医院分离率最高的条件致病菌。近年来，随着对3类或3类以上抗菌药表现耐药的多重耐药(MDR)的PA不断增加，给临床抗感染治疗带来了极大困难。PA的耐药机制非常复杂，包括产生多种β-内酰胺酶、氨基糖苷类抗菌药物修饰酶、外膜孔蛋白D2 (OprD2)缺失、外排机制等[1-3]。为了解我院临床分离的铜绿假单胞菌耐药基因，我们对34株多重耐药PA菌的表型及其β内酰胺酶基因及Ⅰ类整合子进行了检测与分析。
1 材料与方法
1.1 菌株来源及鉴定
所有菌株分离自江苏大学附属医院2007～2009年临床送检的痰液、尿液、脓液等标本，共34株。细菌的分离与鉴定参照《全国操作规程》第3版，并经VITEK GNI+鉴定卡鉴定。标准菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC25922。
1.2 药敏试验及药敏纸片
采用K-B法对临床分离的铜绿假单胞菌进行15种药敏试验。根据CLSI 2009年版标准规定的临界值判读药敏结果。其中氨曲南(AZM)、头孢哌酮(CFP)、头孢哌酮/舒巴坦(C/S)、左氧氟沙星(LVF)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、头孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)、庆大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、奈替米星(NET)购自北京天坛药物生物有限公司，亚胺培南(IMP)购自英国Oxoid公司，头孢吡肟(FEP)购自美国BD公司。水解酪蛋白(MH)琼脂，购自杭州天和有限公司。
1.3 耐药基因检测
1.3.1 模板DNA提取
挑纯培养细菌菌落少许置入50 μL灭菌水中，置100 ℃水浴10 min， 8 000 r/min 30 s，上清液即为DNA模板液。
1.3.2 基因扩增
oprD2基因热循环参数为93 ℃预变性3 min→93 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，最后一个72 ℃延伸5 min，共循环35周期。其余基因热循环参数为：93 ℃预变性3 min→93 ℃ 60 s→55 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s，最后一个72 ℃延伸5 min，共循环35周期。纯水为阴性对照。经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR方法引物序列见表1[4-5]。
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1.4 试剂 PCR所需引物由上海生工技术有限公司合成， TaKaRa DR001A Tag酶为上海(大连)宝生公司产品;Mark为TaKaRa公司产品; GNI+鉴定卡为上海祥和科技有限公司产品。 1.5 VITEK32型全自动微生物鉴定药敏测试仪，高速低温，梯度PCR扩增仪，Gene Genius凝胶成像仪，恒温水浴箱等。 2 结果 2.1 药敏结果分析 34株多重耐药铜绿假单胞菌体外对15种抗生素的药敏结果见表2。从表2中可见，多重耐药铜绿假单胞菌对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、阿米卡星的敏感率较高，分别为55.88%、55.88%、55.88%、50%、47.06%。 2.2 β内酰胺酶基因及Ⅰ类整合子检测结果 检出率最高的是qacE△1-sul1，占91.18%，与其体外复方新诺明药敏试验结果基本符合。其他基因检出率由高到低为oprD2缺失(47.06%)，TEM(44.12%)，OXA-10(38.24%)，VIM(11.76%)，SPM(8.82%)，VEB(5.88%)，未检出IMP、GIM、PER、GES、CARB、DHA、CTX-M、intⅠ1。同一株细菌可同时携带2种或2种以上的耐药基因，有多种基因型组合方式，有TEM+SHV+OXA-10+qacE△1-sul1; TEM+SHV+OXA-10+VEB等多种基因组合。表1 耐药基因引物序列表2 34株铜绿假单胞菌对15种抗生素的药敏结果 3 讨论 OprD2被认为是亚胺培南扩散的通道，其缺失可导致细菌对亚胺培南的耐药，使得临床亚胺培南治疗失败。34株多重耐药铜绿假单胞菌共检出OprD2缺失菌占47.06%，OprD2缺失菌株大多伴有其他耐药基因的存在，单纯OprD2缺失只有一株。可见本院铜绿假单胞菌对亚胺培南产生耐药的机制是复杂的。 整合子水平式传播是介导革兰阴性菌特别是肠道菌和假单胞菌属细菌多重耐药的重要原因。现已确认起最主要作用的为Ⅰ类整合子[6,7]。 intⅠ1与qacE△1-sul1基因为Ⅰ类整合子的遗传标记，单独或同时阳性均表明细菌存在Ⅰ类整合子。I类整合子可同时携带多种耐药基因，造成大面积的细菌同时对某类(种)抗生素耐药。Ⅰ类整合子最常见，其5′保守端有编码整合酶的Ⅰ类整合酶基因intⅠ1 及启动子，大多数3′保守端有3个ORF：季铵盐化合物及溴乙锭的耐药基因(qacE△1)、磺胺耐药基因(sul1)、功能不明的开放阅读框架ORF5。本研究检测34株铜绿假单胞菌qacE△1-sul1，发现有31株(91.2%)为阳性，表明本组菌株Ⅰ类整合子携带率很高，与文献报道基本一致[8]。qacE△1同时也是消毒剂耐药基因，其产物可使多种化合物排出胞外，赋予细菌对季铵类、双胍类消毒剂耐药。sul1为二氢蝶酸合成酶的编码基因，阳性提示细菌对磺胺类药物耐受。本组34株PA均对复方新诺明全部耐药，表明研究菌株的基因型与表型符合。 近来不断发现水解卡巴配能的金属酶IPM、VIM、SPM、SIM和GIM，有些还引起了医院的爆发流行[9,10]。VIM已在我国许多地区发现，以VIM-2型为主，SPM型在我国尚未有此基因型的报道。本研究检出VIM(11.76%)，SPM(8.82%)，未检出IPM和GIM。 TEM、SHV、OXA、CTX-M、VEB、GES等是常见的超广谱β内酰胺酶，本研究对34株铜绿假单胞菌进行上述基因的检测，结果显示本地区以TEM、OXA-10流行为主。 【参考文献】 1 Doi Y， Ghilardi A C. R， Adams J，et al. High prevalence of metallo-β-lactamase and 16S rRNA methylase coproduction among imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates in Brazil[J]. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(9)： 3388-3390.
2 Gutie 作者：万 瑛1，阴 晴1，成 静2，段秀杰1，高 雁1，陆建成1 作者单位：(1.江苏大学附属医院检验科，江苏 镇江 212001;2.江苏大学基础医学与技术学院，江苏 镇江 212013) |
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