外源基因在原核细胞表达技术

原核细胞
*用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因
 含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR修饰或限制性内切酶消化分离DNA片段，片段5’端和3’端带有与IPTG诱导表达载体对应的限制酶位点。
2.含靶cDNA/基因的DNA片段与表达载体连接。
3.重组质粒转化有lacI^q 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有lacI基因，可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（50μg/ml）的LB平板，于37℃过夜培养。
4.通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。
 诱导靶蛋白表达的优化
 许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5.对照菌和重组菌分别挑取1～2个菌落，接入1 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，适当温度（20～37℃）培养过夜。
大肠杆菌在室温的生长速率比在37℃慢4倍，所以～20℃培养过夜（16 h）可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。
6.取50μl过夜培养物接入5 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，20～37℃振荡培养2 h以上，至对数中期（A₅₅₀=0.5～1.0）。
7.吸出1 ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤9和10所述进行处理。
8.在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1 mmol/L，20～37℃继续通气培养。
IPTG的浓度对表达水平影响非常大。1 mmol/L只是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中，应在0.01～5.0 mmol/L的范围内改变IPTG浓度，寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录，才不致于使细菌的生物合成系统过载。
影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。虽然在15～42℃之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围则可能很窄，只有2～4℃。温度有时对表达水平起着决定作用，而有时却对表达水平没有任何影响，这其中的原因还有待进一步研究，但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。这些因素包括：细菌生长速率、表达产物的胞内折叠、辅基（血红素、黄素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可获得性、外源蛋白的热变性、细胞分泌或折叠器的过载、内原蛋白酶或其他裂解酶的活性、细菌SOS修复系统的激活等。由于这些不确定因素的存在，理论推断最佳生长温度是不可*的，必须进行反复的实验。
9.在诱导的不同时间（如1、2、4和6 h）取1 ml样品放于微量离心管中，测定A₅₅₀，室温高速离心1 min。
10.沉淀悬于100μl 1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3 min，室温高速离心1 min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。
11.样品加热至室温，取40μg或相当于0.15 OD₅₅₀培养物的悬液上于10% SDS聚丙烯酰胺凝胶。
12.8～15 V/cm点泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13.考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带。
   37℃诱导30 min的阳性对照，有一条分子质量为26 kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）带，GST的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带，诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于GST对照。
 大量表达靶蛋白
14.挑取一个重组大肠杆菌菌落接入50 ml含氨苄（50μg/ml）的LB培养液，在250 ml摇瓶中于20～37℃过夜培养。
15.取5～50 ml过夜培养物接入450～500 ml含氨苄（50μg/ml）的LB培养液，在2L摇瓶中于20～37℃振荡培养过夜，至对数中期（A₅₅₀=0.5～1.0）。
16.以预试验确定的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。
17.诱导适当时间后，于4℃以5000g（5500 r/min Sorvall GSA转头）离心15 min收集细胞，继续后面的纯化方案。
*用T7噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1. PCR修饰或限制性内切酶消化分离DNA片段，片段5’端和3’端带有与T7噬菌体启动子表达质粒（如pET载体；Studier et al. 1990）对应的限制酶位点。
2.含靶cDNA/基因的DNA片段与表达载体连接。
3.连接产物转化大肠杆菌菌株HMS174（DE3）或BL21（DE3）。将转化体铺于含氨苄（50μg/ml）的NZCYM平板，于37℃过夜培养。
4.通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。
 诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5.对照菌和重组菌分别挑取1～２个菌落，接入1 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的NZCYM培养液，37℃培养过夜至饱和。
6.取50μl接入5 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）NZCYM培养液，在50 ml摇瓶中于37℃培养2 h。
7.吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤9和10所述进行处理。
8.在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1 mmol/L，20～37℃继续通气培养。
9.在诱导的不同时间（0.5、1、2和3 h）取1 ml样品放于微量离心管中，测定A₅₅₀，室温高速离心1 min。
10.沉淀悬于100μl 1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3 min，室温高速离心1 min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。
11.样品加热至室温，取40μg或相当于0.15 OD₅₅₀培养物的悬液上样于10% SDS聚丙烯酰胺凝胶。
12. 8～15 V/cm电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13.考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带。
 大量表达靶蛋白
14.挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入50 ml含氨苄（50μg/ml）的NZCYM培养液，在250 ml摇瓶中于37℃过夜培养。
15.取5～50 ml过夜培养物接入450～500 ml含氨苄（50μg/ml）的NZCYM培养液，在2 L摇瓶中于37℃振荡培养至对数中期（A₅₅₀=0.5～1.0）。
16.以预试验确定的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。
17.诱导适当时间后，于4℃以5000g（5500 r/min Sorvall GSA转头）离心15 min收集细胞，继续后面的纯化方案。