组织免疫荧光染色

　　概述：

　　织免疫荧光染色多是使用组织的冰冻切片，因为在切片过程中基本上暴露了细胞和细胞核内结构，故不需要使用细胞通透剂(Triton-100,NP-40)。染色后的切片应放置冰箱内避光保存，防止荧光淬灭。常用的荧光素有：异硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC,发散苹果绿色荧光)；四甲基罗丹明异硫氰(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC，发散橘红色荧光 )

　　一. 组织处理：

　　取出组织后，置于4%多聚甲醛中4-12小时（视组织大小、厚度而定），多聚甲醛的体积应为组织大小的5-10倍。再在20%蔗糖中4℃过夜。OCT（冰冻包埋剂）包埋组织，-20℃或更低的温度进行冰冻。

　　二．冰冻切片：

　　切片可于-40或-80℃中保存。

　　三．染色：

　　1.冰冻切片使用前放湿盒室温1小时复温。

　　2.用组化笔（可用唇膏代替）在组织周围划出范围，以防止此后操作中液体溢出使得组织切片变干。

　　3.PBS洗去OCT 及多聚甲醛，用PBS 洗切片，10min×3。

　　4.0.1%TritonX-100，30min。主要用于细胞打孔，有利于抗体进入细胞。用PBS 洗切片，10min×3。

　　5.加山羊血清，4℃过夜，主要用于预封闭抗原，减轻背景染色。

　　6.加一抗，4℃过夜。一抗浓度根据说明书而定，如果无说明，则进行1:50 , 1:100 , 1:200 , 1:400 , 1:800摸索适合的浓度。PBS洗去一抗，10min×3。

　　7.加荧光二抗，37℃孵育30min或室温1~2h（此后步骤于暗室操作）。二抗浓度一般1:100或1:200。PBS洗去二抗，10min×3。

　　8.滴碳酸盐缓冲甘油于片上，盖盖玻片。用透明指甲油封于盖玻片四周。

　　9.暗盒中4℃保存切片，共聚焦显微镜或荧光显微镜观察结果。

　　四．试剂配制

　　1.多聚甲醛和蔗糖溶液均用0.01M的PBS来配制。

　　2.所有抗体用1%BSA（用PBS溶解BSA）稀释。如果切片中荧光点难以洗去，则用PBS稀释抗体。

　　3.封片所用甘油为甘油缓冲液：甘油（分析纯）20ml，加入0.5M碳酸盐缓冲液20ml，充分混匀，待其中的气泡完全消失后即可使用。

　　4.0.5M碳酸盐缓冲液（pH9.5）的配制：NaHCO3 3.7g ； Na2CO3 0.6g ； H2O 100ml，混合溶解，测定并校正pH值。